Método para el aislamiento de ácidos nucleicos.

Método para el aislamiento y/o purificación de ácidos nucleicos de cadena corta,

en particular ADN y/o ARN, con una longitud de< 1000 pares de bases, de un material de partida que contiene ácido nucleico, caracterizado por las siguientes etapas del método:

(a) unión de los ácidos nucleicos a un material de soporte que liga ácidos nucleicos, en la cual se pone en contacto el material de partida con el material de soporte que liga ácidos nucleicos, en presencia de por lo menos un compuesto caotrópico y por lo menos un alcohol ramificado y/o no ramificado, preferiblemente isopropanol, donde el alcohol está presente en una concentración ≥ 15 % (v/v) y ≤ 32% (v/v) y donde el material de soporte que liga ácidos nucleicos es una fase sólida que liga ácidos nucleicos, elegida de entre el grupo de los materiales que contienen sílice, en gel de sílice, dióxido de silicio, vidrio, zeolita, caolín, sílica gel, cerámica, membranas de sílice y partículas magnéticas, que exhiben una superficie de sílice o de vidrio;

(b) opcional elución de los ácidos nucleicos unidos, del material de soporte que liga ácidos nucleicos

Método para el aislamiento de ácidos nucleicos

La presente Invención se refiere a un método para el aislamiento y/o concentración de ácidos nucleicos, en particular de ácidos nucleicos de cadena corta.

El aislamiento de ácidos nucleicos como ADN y ARN a partir de materiales vegetales, animales o humanos así como a partir de cultivos celulares o cultivos de virus ocurre por regla general según un patrón básico consistente: los ácidos nucleicos presentes en materiales de partida son primero descompuestos - parcialmente empleando enzimas que degradan proteínas. En etapas subsiguientes los componentes individuales pueden ser separados empleando diferentes métodos. Además, los ácidos nucleicos pueden ser aislados de materiales de muestras, en los cuales ellos están libres, es decir no están en células. De este modo, los ácidos nucleicos pueden existir libres en mezclas artificiales de muestras, pero sin embargo también en nuestras naturales como por ejemplo sangre. Tales ácidos nucleicos que circulan libres son denominados también ácidos nucleicos extracelulares.

La mayoría de los métodos conocidos a partir del estado de la técnica para la concentración de los ácidos nucleicos se basa en uno de los dos siguientes principios de separación:

Los métodos clásicos se basan en un proceso de una etapa, en el cual después de la adición de un tampón que en la mayoría de los casos contiene un compuesto caotrópico, y después de la adición de un agente orgánico de extracción - mayormente fenol y/o cloroformo- se ejecuta una extracción. Los indeseados materiales acompañantes son descartados con la fase orgánica. A continuación, mediante una separación de fases, los ácidos nucleicos remanentes en la fase acuosa pueden ser separados y con ello aislados. La desventaja esencial de este modo de operación consiste en que aparte del empleo de materiales dañinos para la salud y venenosos como fenol y/o cloroformo, los materiales solubles en agua permanecen como contaminantes en la solución acuosa de ácido nucleicos, los cuales tienen que ser separados en otras etapas de purificación que consumen mucho tiempo.

De allí que considerando esta desventaja, se ha introducido en el estado de la técnica un proceso alternativo, el cual se basa en la adsorción selectiva de ácidos nucleicos sobre materiales sólidos de soporte, como por ejemplo dióxido de silicio. Si se requiere, el material de partida que contiene ácidos nucleico es sometido a lisis, bajo condiciones definidas puesto en contacto con el material de soporte, de modo que los ácidos nucleicos puede ligarse sobre el material de soporte; dado el caso, se ejecutan etapas de lavado. Opcionalmente, a continuación los ácidos nucleicos unidos al soporte son sometidos a elución del material de soporte por medio de un tampón adecuado.

Por ejemplo, un método adecuado para una multiplicidad de diferentes aplicaciones para el aislamiento de ácidos nucleicos es divulgado en la US 5,234,89 (Boom). Allí se describe un método para el aislamiento de ácidos nucleicos de materiales de partida que contienen ácidos nucleicos, mediante la incubación del material de partida con un tampón caotrópico y una fase sólida que liga ADN. El tampón caotrópico realiza, en tanto sea necesario, tanto la lisis del material de partida como también la unión de los ácidos nucleicos a la fase sólida. El método es bien adecuado para la separación de ácidos nucleicos de pequeñas cantidades de muestra. En W93/11221 se describe también un método que se basa en un principio similar.

EP 1 96 938 divulga un método en el cual a una superficie de sílice se unen ácidos nucleicos en presencia de un compuesto caotrópico y/o un alcohol ramificado o no ramificado. La inmovilización de los ácidos nucleicos ocurre a elevadas temperaturas. WO99/6163 divulga un método de purificación de plásmidos, en el cual los ácidos nucleicos se ligan a un material de sílice en presencia de agentes caotrópicos. La US 27/1671 se refiere a un método para la purificación de ácidos nucleicos de diferente longitud, en el cual se emplean fases que ligan ácidos nucleicos, con diferentes tamaños de poro.

En el estado de la técnica se conocen muchos métodos para la purificación de ácido nucleicos, los cuales consisten en la combinación de una fase sólida con un tampón caotrópico. Puesto que en todos los métodos conocidos, los ácidos nucleicos de cadena larga se ligan a la fase sólida por lo menos tan bien, sin embargo en la mayoría de los casos esencialmente mejor comparados con ácidos nucleicos de cadena corta (por ejemplo con una longitud menor a 1 pares de bases, 5 pares de bases o incluso 3 pares de bases), los métodos del estado de la técnica no son adecuados para purificar de manera eficiente ácidos nucleicos de cadena corta o bien concretamente concentrarlos respecto a los ácidos nucleicos de cadena larga.

La mala aptitud para purificar ácidos nucleicos de cadena corta, es presumiblemente atribuible a que los ácidos nucleicos de cadena corta se ligan mal al material de soporte, comparados con ácidos nucleicos de cadena larga (por

ejemplo ADN genómico). Por ello, en la mayoría de los procesos de purificación establecidos los ácidos nucleicos de cadena corta se pierden en una gran parte y no se encuentran o están representados de manera inadecuada en los ácidos nucleicos purificados. Sin embargo, para determinadas aplicaciones es deseable aislar ácidos nucleicos de cadena corta, o concentrar estos respecto a los ácidos nucleicos de cadena larga.

Para concentrar preferiblemente ácidos nucleicos de cadena corta o bien separar ácidos nucleicos de cadena corta de los de cadena larga, se aplicaron ya en el estado de la técnica diferentes principios. Por ejemplo, DE 1 26 45 391 describe un método para la separación de ácidos nucleicos largos de ácidos nucleicos cortos, en el cual se aplica la muestra varias veces sobre fases sólidas especialmente modificadas. Otro método se basa en el empleo de tampones especiales de unión, que no contienen sales caotróplcas, sino sales de ácido cítrico, para ligar de este modo en particular ácidos nucleicos de cadena corta (WO 27/65934).

La purificación/concentración de ácidos nucleicos de cadena corta (ARN y ADN) es de importancia central para diferentes ámbitos de aplicación. Un campo en el cual los ácidos nucleicos de cadena corta juegan un papel central es el diagnóstico prenatal. Aparte del ADN particular que circula libre, en la sangre de mujeres embarazadas se encuentra adicionalmente aún ADN que circula libre del feto. Se asume que el ADN fetal que circula libre en la sangre de mujeres embarazadas se diferencia del ADN que circula libre de la madre, en su tamaño. Mientras frecuentemente el ADN materno que circula libre posee una longitud promedio superior a 5 pares de bases, una parte predominante del ADN fetal que circula libre es claramente más pequeña y posee en promedio una longitud inferior a 5 pares de bases. Esta diferencia de tamaño entre los ácidos nucleicos materno y fetal podría ser empleada para concentrar ADN fetal y con ello poder investigar mejor, en tanto se tuvieran a disposición métodos adecuados de purificación. El uso de ADN que circula libre de origen fetal para el diagnóstico prenatal tendría como ventaja que sería inocuo para el feto respecto a los métodos clásicos como la amniocentesis o la blopsia de vellosidades coriónicas y con ello implicaría menos riesgos. Sin embargo, las cantidades de ADN que circula libre de origen fetal en la sangre son muy bajas. Dependiendo del estado de gestación, en 1 mi de sangre se encuentran entre 2 y 26 copias de ADN fetal. La concentración de ADN que circula libre fetal es con ello incluso menor, pero todavía superior a la concentración de células fetales que circulan libres. Además existe el problema de que la concentración del ADN fetal que circula libre es notablemente pequeña en comparación con el ADN materno que circula libre, de modo que para el aislamiento total del ADN que circula libre de la sangre materna, sólo una fracción del material genético proviene del feto; la parte predominante del material genético aislado proviene de la madre. Por la elevada cantidad de fondo de ADN materno, en muchos casos se complica la detección de fragmentos genéticos del feto, en algunos casos no es suficiente la sensibilidad en sí misma de métodos de detección tan sensibles como el PCR en tiempo real, para poder detectar el ADN fetal.

Los métodos empleados hasta ahora para el aislamiento de ADN que circula libre, de la sangre materna purifican frecuentemente en la misma medida el ADN fetal y el ADN materno, de modo que persiste la relación inconveniente de ADN fetal a ADN materno -el ADN fetal representa... [Seguir leyendo]

1. Método para el aislamiento y/o purificación de ácidos nucleicos de cadena corta, en particular ADN y/o ARN, con una longitud de < 1 pares de bases, de un material de partida que contiene ácido nucleico, caracterizado por las siguientes etapas del método:

(a) unión de los ácidos nucleicos a un material de soporte que liga ácidos nucleicos, en la cual se pone en contacto el material de partida con el material de soporte que liga ácidos nucleicos, en presencia de por lo menos un compuesto caotróplco y por lo menos un alcohol ramificado y/o no ramificado, preferiblemente ¡sopropanol, donde el alcohol está presente en una concentración 2 15 % (v/v) y < 32% (v/v) y donde el material de soporte que liga ácidos nucleicos es una fase sólida que liga ácidos nucleicos, elegida de entre el grupo de los materiales que contienen sílice, en gel de sílice, dióxido de silicio, vidrio, zeolita, caolín, sílica gel, cerámica, membranas de sílice y partículas magnéticas, que exhiben una superficie de sílice o de vidrio;

(b) opcional elución de los ácidos nucleicos unidos, del material de soporte que liga ácidos nucleicos.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a) el alcohol está presente en la mezcla en una concentración de s 25% (v/v).

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la concentración del compuesto caotrópico en la etapa a) está en 2 2 mol/l y s 3,5 mol/l y el compuesto caotrópico es elegido de entre el grupo de los tiocianatos, isotiocianatos o percloratos.

4. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por uno o varios de los siguientes rasgos:

a. que la concentración de los compuestos caotrópicos en la mezcla en la etapa (a) es 4 mol/l, <3,5 mol/l, < 3,2 mol/l o

s 3,1 mol/l; y/o

b. que el por lo menos un compuesto caotrópico en la etapa (a) es un tiocianato, ¡sotiocianato o perclorato; y/o

c. que por lo menos 3%, 5% y preferiblemente por lo menos 6% de los ácidos nucleicos de cadena corta presentes en el material de partida pueden ser separados por medio del método; y/o

d. que los ácidos nucleicos de cadena corta son aislados y/o enriquecidos con una longitud, que son elegidos de entre el grupo de los ácidos nucleicos con una longitud de < 5 pares de bases, £ 4 pares de bases y/o £ 3 pares de bases y/o > 5 pares de bases y/o 2 1 pares de bases.

5. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos extracelulares.

6. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico que va a ser alslado/concentrado es ADN.

7. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el material de soporte que liga ácidos nucleicos es elegido de entre partículas magnéticas de sílice o vidrio.

8. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, para el aislamiento y/o concentración de ácido nucleicos extracelulares, en particular fetales, de una muestra de sangre, en particular suero o plasma de sangre.

9. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8 para el aislamiento y/o concentración de ácido nucleicos extracelulares y/o de cadena corta de una muestra, excluyendo la concentración de ácidos nucleicos fetales de una muestra de sangre.

1. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, para el aislamiento y/o concentración de ácidos nucleicos de cadena corta a partir de sangre, plasma, suero, orina y líquido cerebral.

11. Método según una o varias de las reivindicaciones 5 a 1, para el aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares elegidos de entre ADN fetal, ADN y ARN tumoral, de plasma y/o suero.

12. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque primero se hace lisis a la muestra y/o se liberan ácidos nucleicos.

13. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el alcohol es isopropanol.

14. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque no se realiza ninguna extracción con fenol.

15. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque los ácidos nucleicos de cadena corta son de cadena individual o cadena doble.

16. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la concentración de alcohol en la etapa a) está en un rango de > 15 % (v/v) y < 25% (v/v) y la concentración del compuesto caotrópico en la etapa a) está en s 2 mol/l.

17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque el compuesto caotrópico es tiocianato de guanidinio o isotiocianato de guanidinio.

18. Método según la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque el alcohol en la etapa a) está en una concentración de 18 a 2% (v/v).

19. Método según una o varias de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la concentración de alcohol en la etapa a) es < 25% (v/v) y la concentración del compuesto caotrópico en la etapa a) está en > 2mol/l y < 3.1 mol/l y donde el compuesto caotrópico es tiocianato de guanidinio o isotiocianato de guanidinio.

2. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el material de soporte que liga ácidos nucleicos se encuentra en una columna.

21. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el material de soporte que liga ácidos nucleicos es una membrana de sílice.

22. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque durante la unión están presentes detergentes, preferiblemente detergentes no iónicos.

23. Método según una o varias de las reivindicaciones 1 a 22 para la aplicación en el diagnóstico.