Método para detectar microorganismos del género Kingella.

Un método para detectar la presencia de un microorganismo de Kingella kingae en una muestra biológica de un paciente,

que comprende las etapas de

a. Llevar a cabo una amplificación PCR del ADN en dicha muestra con el par de cebadores de SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 3

b. Detectar la presencia o la ausencia de un ácido nucleico amplificado, en el que la presencia de un ácido nucleico amplificado supone la presencia de un microorganismo de Kingella kingae en dicha muestra biológica.

Método para detectar microorganismos del género K/nge//a

La artritis séptica aguda en niños tiene que diagnosticarse y tratarse urgentemente debido al riesgo de secuelas a largo plazo. La identificación del organismo causante es necesaria para optimizar la selección de anticuerpos, pero los cultivos son negativos en de un tercio a dos tercios de los pacientes [1-3]. La K/nge//a L/ngae, un cocobacilo Gram-negativo, es parte de la flora orofaríngea normal de los niños desde los 6 meses hasta los 4 años [4, 5]. Inicialmente se consideró una causa rara de enfermedades invasivas, incluyendo infecciones esqueléticas en niños y endocarditis en adultos. Sin embargo, el número comunicado de casos de artritis por K. fr/ngae ha aumentado de manera notable desde la década de 1990, principalmente debido a mejoras en las técnicas de cultivo, tales como inoculación de viales de cultivo sanguíneo con especímenes de articulación [3, 6]. En la bibliografía, K. fdngae supone actualmente del 5 % al 29 % [2, 7-9] de infecciones osteoarticulares (IOA) positivas a cultivo, y hasta un 48 % de los casos de artritis séptica en niños de menos de 2 años de edad [10].

K. fdngae es un microorganismo fastidioso y es posible que su frecuencia en la IOA esté subestimada. De hecho, varios métodos moleculares han demostrado recientemente una mayor prevalencia de K. L/ngae de la que se había comunicado anteriormente en este escenario. Rosey ef a/, y Verdier ef a/, usando un método de PCR de ADN ribosomal 16S universal, encontraron secuencias de K. fdngae en un 18% y un 14% de especímenes de cultivo negativo de niños con IOA [2, 9]. Recientemente, Chometon ef a/., usando un método de PCR en tiempo real sin sonda, descubrieron que K. fongae era la causa principal de IOA en niños en Lyon (Francia) [7].

La detección de ADN bacteriano no proporciona pruebas irrefutables de que la bacteria relevante tiene un papel patogénico [11]. De hecho, Dagan ef a/ han demostrado que el ADN de organismos que colonizan el tracto respiratorio, tales como neumococos, pueden detectarse mediante PCR en suero de pacientes no infectados [12]. Por lo tanto, dada la habilidad de K. fdngae de colonizar el tracto respiratorio de niños pequeños [5], se necesita un control adecuado para confirmar la relevancia de los diagnósticos basados en PCR.

A diferencia del cultivo, los métodos moleculares pueden detectar un patógeno durante hasta varios días o semanas después de comienzo de terapia antibiótica eficaz en varias enfermedades infecciosas [13-16]. A este respecto, sería de interés determinar la contribución de la PCR para diagnosticar la infección por K. fr/bgae en niños que ya han recibido antibióticos antes de la aspiración de fluido articular.

La presente invención describe y evalúa un nuevo método de PCR en tiempo real específico para K. fongae con una sonda fluorogénica, y lo aplica a muestras de sangre y de fluido articular de niños en los que se sospecha que tienen artritis séptica aguda. También se describen las características de la artritis por K. fr/ngae en este grupo.

La invención, por lo tanto, se refiere a un método para detectar la presencia de un microorganismo del género K/nge//a en una muestra biológica de un paciente, que comprende la amplificación mediante la PCR de una parte de un gen de chaperonina de dicho microorganismo, como se especifica más adelante.

Las chaperoninas o chaperonas son proteínas que asisten al plegamiento/desplegamiento no covalente y al ensamblaje/desensamblaje de otras estructuras macromoleculares, pero que no suceden en estas estructuras cuando estas últimas están llevando a cabo sus funciones biológicas normales. Normalmente están relacionadas con el plegamiento de proteínas, pero también asisten al ensamblaje de otras estructuras, tales como nucleosomas de ¡listonas plegadas y ADN. Algunas chaperonas de ensamblaje, especialmente en el núcleo, están relacionadas con el ensamblaje de subunidades plegadas en estructuras oligoméricas.

La estructura aminoacídica de las chaperoninas está bastante conservada entre especies. Como ejemplo, hay cierto grado de identidad entre cpn60 de K. /r/ngae y la proteína ortóloga en /Ve/sser/a.

Para identificar las proteínas chaperoninas en K/nge//a, es posible diseñar una sonda a partir de una región conservada de una chaperonina de otros microorganismos, y usar esta sonda en el genoma de K/nge//a. Dicho genoma se ha cortado y clonado preferentemente en vectores, tales como BAC o cósmidos. La hibridación de la sonda a uno (o más) de los vectores indica la presencia de un gen que presenta homología con esta sonda en dicho vector. Por lo tanto es posible secuenciar el vector, identificar el gen y confirmar que codifica una proteína chaperonina. Dicho método (y otros) se conocen bien por el experto en la materia.

Como alternativa, es posible secuenciar el genoma completo de un microorganismo de K/nge//a. La secuenciación de un genoma bacteriano completo está bien descrito en la técnica. Por lo tanto es posible predecir las secuencias codificantes en este genoma, usando programas informáticos específicos (esto es también más fácil de hacer en secuencias genómicas bacterianas que en secuencias genómicas eucariotas, debido a la ausencia de intrones). La comparación de las proteínas predichas con bases de datos dará lugar a la identificación de proteínas chaperoninas del genoma de K/nge//a.

En la Invención, dicho gen de chaperonlna es un cpn60, una secuencia parcial del cual está representada por la SEC ID N°: 1. La SEC ID N°: 1 corresponde a la secuencia de GenBank AY123650. Cpn60 probablemente corresponde a GroEL en fsc/ier/c/i/a co//.

La familia de proteínas GroEL está bien descrita en la técnica. Brocchieri y Karlln (Proteln Science, 2000, 9:476-86) ha descrito la conservación entre secuencias de Hsp60 (otro nombre de GroEL) en relación a la estructura, función y evolución. El péptldo obtenido de la traducción de SEC ID N°: 1 presenta aminoácidos que son específicos de una proteina GroEL. Usando esta homología de secuencias, es fácil Identificar proteínas cpn60 de K/nge//a.

Los Inventores han Identificado una secuencia en esta proteina, conservada entre varías cepas biológicas, y determinados cebadores y sondas específicos que pueden usarse para detectar la presencia de dicho gen en una muestra de un paciente. La presencia de este gen supone la presencia del huésped, es decir, el microorganismo de K/nge//a.

En particular, dicha secuencia conservada comprende los nucleótldos 225 a 399 de SEC ID N°: 1, y puede amplificarse con un par de cebadores seleccionados entre (SEC ID N°: 2/SEC ID N°: 3) y (SEC ID N°: 4/SEC ID N°: 5). Por lo tanto se pretende usar SEC ID N°: 2/SEC ID N°: 3, en particular, para la detección específica de K. /r/ngae.

Dichos ácidos nucleicos amplificados comprenden las secuencias ¡lustradas de SEC ID N°: 11 a SEC ID N°: 16. Estas seis secuencias corresponden a productos amplificados de cepas de referencia y de cepas aisladas de pacientes.

El método de la Invención hace posible detectar la presencia de microorganismos del género K/nge//a, y en particular de K/nge//a k/ngae.

La muestra biológica con la que se lleva a cabo la amplificación es cualquier muestra biológica (en particular, sangre, orina, fluido cefalorraquídeo, tejido endocàrdico o muestra ósea). Sin embargo, debido a la naturaleza del microorganismo buscado, el método se lleva a cabo ventajosamente en una muestra de fluido articular.

El método de la Invención se lleva a cabo en una muestra biológica que se ha recogido previamente de un paciente, mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización preferida, dicho paciente es un niño de menos de 15 años. De hecho, las Infecciones por K/nge//a están presentes con más frecuencia en niños. En otra realización, dicho paciente es un niño de menos de 5 años.

El método de la Invención es Interesante para evaluar o confirmar un diagnóstico de una infección por K/nge//a en un paciente que tiene artritis aguda, osteomielitis o endocarditis.

La amplificación se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la materia. Los documentos U.S. 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159, y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR emplea tipicamente dos cebadores ollgonucleotídlcos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN) desnaturalizado mediante calentamiento. Una pollmerasa termoestable cataliza la formación de los productos de extensión del cebador complementarlos al molde.

La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) hace posible determinar la cantidad de un ADN específico en una muestra. Puede llevarse a... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de un microorganismo de K/nge//a k/ngae en una muestra biológica de un paciente, que comprende las etapas de

a. Llevar a cabo una amplificación PCR del ADN en dicha muestra con el par de cebadores de SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 3

b. Detectar la presencia o la ausencia de un ácido nucleico amplificado, en el que la presencia de un ácido nucleico amplificado supone la presencia de un microorganismo de K/nge//a /vngae en dicha muestra biológica.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación es una PCR en tiempo real.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la detección del producto de amplificación se lleva a cabo con una sonda de SEC ID N°: 7.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha muestra contiene 6-carboxlfluoresceína en su extremo 5' e ¡nactlvador de agujero negro 1 en su extremo 3'.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica es una muestra de fluido articular.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho paciente es un niño de menos de 15 años de edad.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho paciente tiene artritis aguda.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6, en el que dicho paciente tiene endocarditis.

9. Un kit para detectar un microorganismo del género K/nge//a que comprende un par de cebadores de SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 3 y la sonda de secuencia SEC ID N°: 7.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que dicha muestra contiene 6-carboxifiuoresceína en su extremo 5' e ¡nactivador de agujero negro 1 en su extremo 3'.