Método mejorado para el tratamiento de bisulfito.

Procedimiento para la conversión de una base de citosina, en un ácido nucleico,

a una base de uracilo, que comprende las etapas de a) incubar una solución que comprende el ácido nucleico, durante un período de tiempo de 1, 5 a 3, 5 horas, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes comprendidos entre 70 y 90°C, en donde, la concentración de bisulfito, en la solución, es de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 3 M y 6, 25 M, y en donde, el valor pH de la solución, es de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 5, 0 y 6, 0, en donde, el ácido nucleico, se desamina, y b) incubar la solución que comprende el ácido nucleico desaminado, bajo condiciones alcalinas, a cuyo efecto, el ácido nucleido desaminado, se desulfona.

Método mejorado para el tratamiento de bisulfito Sector de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para realizar una reacción de bisulfito para determinar las posiciones de metilación en un ácido nucleico, es decir, citocinas metiladas y no metiladas, a cuyo efecto, el ácido nucleico, se incuba en una solución que comprende el ácido nucleico, durante un transcurso de tiempo que va de 1,5 a 3,5 horas, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre 7 y 9°C, y en donde, las concentración de bisulfito en la solución, es de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 3 M y 6,25 M, y en donde el valor de pH de la solución es el correspondiente a un valor comprendido entre 5,25 y 5,75, en donde el ácido nucleico, es decir, las bases de citosina en el ácido nucleico, se desamina. A continuación, la solución que comprende el ácido nucleico desaminado, se desulfona y, de una forma preferible, se desaliniza. La solicitud se refiere adicionalmente, a un equipo a modo de "kit", con una solución que comprende bisulfito, con un determinado valor de pH y usos de éste, así como también a un equipo a modo de "kit", que comprende la solución.

Antecedentes v trasfondo de la invención

Los genes, constituyen únicamente una pequeña proporción de genoma total de los mamíferos, y el control preciso de su expresión, en presencia de un contundente historial de ácido desoxirribunucleico (ADN) no codificante, presenta un sustancial problema para su regulación. El ADN no codificante, que contiene intrones, elementos repetitivos, y elementos transponibles, requiere un mecanismo efectivo para su silenciación a largo plazo. Los mamíferos parecen haber obtenido ventaja de las posibilidades proporcionadas por la metilación de citocinas para proporcionar un mecanismo hereditario para modificar las interacciones ADN - proteínas para ayudar en dicha silenciación. La metilación de ADN es esencial para el desarrollo de los mamíferos y juega un rol interpretativo potencial durante el envejecimiento y el cáncer. El compromiso de la metilación en la regulación de la expresión de genes y como una modificación epigenética que marca genes provistos de impronta, se encuentra bien establecida. En los mamíferos, la metilación acontece únicamente en residuos de citosina y, de una forma más específica, únicamente en residuos de citosina adyacentes a un residuo de guanosina, es decir, en la secuencia CG. La detección y elaboración de mapas de sitios de metilación de ADN, son etapas esenciales hacia el entendimiento de las señales moleculares, las cuales indican si una secuencia dada, se encuentra metilada.

Esto se realiza, actualmente, mediante el denominado procedimiento de bisulfito, descrito por parte de Frommer, M., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 1827 - 1831, para la detección de 5-metil-citosinas. El procedimiento de bisulfito de elaboración de mapas de 5-metilcitosina, utiliza el efecto consistente en que el hidrogenosulfito de sodio, reacciona con citosina, pero no, o sólo de una forma escasa, con 5-metil-citosina. La citosina, reacciona con bisulfito, para formar un intermediario de reacción de citosina sulfonada, el cual es propenso a la desaminación, dando como resultado un uracilo sulfonado, el cual puede desulfonarse a uracilo en condiciones alcalinas (véase la figura 1). Es de conocimiento corriente, el hecho de que el uracilo, tiene el comportamiento de apareamiento de bases de timina, diferente al educto citosina, mientras que la 5-metilcitosina tiene el comportamiento de apareamiento de bases de citosina. Esto hace posible la discriminación de citosinas metiladas o no metiladas mediante, por ejemplo, la secuenciación genómica con bisulfito (Grigg. G., y Clark, S. Bioessays 16 (1994) 431 - 436; Grigg, G. W., DNA Seq. 6 (1996) 189 - 198) o PCR específica de metilación (MSP), dada a conocer en la patente estadounidense US 5.786.146. Se han realizado estudios básicos sobre la reacción de uracilo y derivados de la citosina con bisulfito, por parte de Shapiro et al., JACS 92 (197)422 - 424.

Existen varios documentos que hacen referencia a los aspectos específicos de la reacción de bisulfito.

Hayatsu, H., et al., Biochemistry 9 (197) 2858 - 2865, hicieron reaccionar cistosina, o sus derivados, con bisulfito 1 M, a un valor de pH de alrededor de 6, a una temperatura de 37°C, durante un transcurso de tiempo de 24 horas. Hayatasu, H., et al., J. Am. Chem. Soc. 92 (197) 724 - 726, describen la reacción de citosina con bisulfito 3 M, a un valor de pH de alrededor de 6, a una temperatura de 8°C, durante un transcurso de tiempo de 3 minutos. Slae y Shapiro, J. Org. Chem. 43 (1978) 4197 - 42, describen la desaminación de citidina, con bisulfito 1 M, a un valor de pH alrededor de un valor neutro, a varias temperaturas, y en donde, no se describe el tiempo de reacción. No hubo investigaciones de la determinación de citosina o metil-citosina en ácidos nucleicos, en estos documentos.

Paulin, R. et al. Nucí. Acids Res. 26 (1998) 59 - 51, investigaron los efectos de la urea en la eficiencia de la secuenciación de 5-metilcitosina en ADN, mediada por bisulfito. El ADN, se hace reaccionar con bisulfito 3,44 M, en presencia en urea 5,36 M, e hidroquinona ,5 mM, a un valor de pH de 5,, a una temperatura de 55°C, durante un transcurso de tiempo de 15 horas.

Raizis, A. M. et al., Anal. Biochem, 226 (1995) 161 - 166, han dado a conocer un procedimiento de bisulfito para la elaboración de mapas de 5-metilcitosina, el cual minimiza la degradación de moldes. Éstos investigaron un

procedimiento que minimiza la degradación de los moldes, utilizando soluciones de bisulfito 5 M, en presencia de hidroquinona 1 mM, a un valor de pH de 5, a una temperatura de 5°C. Se observó un rendimiento productivo máximo de producto de PCR, después de un transcurso de tiempo de 4 horas. Se investigaron también otras condiciones, como las consistentes en un valor de pH incrementado y bajas temperaturas.

Grunau, C., et al., Nucleic Acids Res 29 (21) e 65- 5, páginas 1 a 7, realizan una investigación de los parámetros experimentales críticos de la reacción de bisulfito. Éstos investigan soluciones de bisulfito de 3,87 a 4,26 M y de 5,2 a 5,69 M, a un valor de pH de 5. Las temperaturas que se sometieron a test de ensayo, son las correspondientes a unos valores de 15, 35, 55, 8, 85 y 95°C, durante un transcurso de tiempo de 1, 4 y 18 horas. La degradación de ADN, es un problema en estas investigaciones.

Wang. R. Y. et al., Nucleic Acids Res. 8 (198) 4777 - 479, dan a conocer el uso de solución de bisulfito 3 M, a un valor de pH de 5,5, a una temperatura de 37°C, durante varios períodos de tiempo, en el tratamiento de ADN, con bisulfito. Feil, R. et al., Nucleic Acids Res 22 (1994) 695 - 696, dan a conocer el uso de una solución de bisulfito 3,5 M, a un valor de pH de 5, a una temperatura de °C, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, en el tratamiento de ADN con bisulfito. Clark, S.J., et al., Nucleic Acids Res 22 (1994), 299 - 2997, dan a conocer el uso de una solución de bisulfito 4,8 a 5,8 M, a un valor de pH de 5, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van de 37 a 72°C, durante un transcurso de tiempo que va de 8 a 16 horas, en el tratamiento de ADN con bisulfito. Tasheva, E.S., y Roufa, D. J. Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 5636 - 5644, dan a conocer el uso de una solución de bisulfito 1 M, a un valor de pH de 5, a una temperatura de 5°C, durante un transcurso de tiempo de 48 horas, en el tratamiento de fragmentos de ADN genómico, con bisulfito. Komiyama, M., y Oshima, S. Tetrahedron Letters 35 (1994) 8185 - 8188, dan a conocer el uso de una solución de bisulfito 1 M, a un valor de pH de 5, a una temperatura de 37°C, durante un transcurso de tiempo de 4 horas, en el tratamiento de ADN con bisulfito, en el cual, se encuentra presente dietilentrietilamina.

Olek, A., et al, Nucleic Acids Res. 24 (1996) 564 - 566 dan a conocer un procedimiento para la secuenciación de bases con bisulfito, en el cual se realiza un tratamiento con bisulfito y subsiguientemente, etapas de PCR en material embebido en perlas de agarosa. Se utiliza una solución de bisulfito 5 M, a un valor de pH de 5, a una temperatura de 5°C, durante un transcurso de tiempo de 4 horas, en el tratamiento de ADN con bisulfito.

Puede verse un análisis de la metilación del ADN, en Oakeley, E. J. Pharmacol. Ther. 84 (199), 389 - 4.

Se dan a conocer diferentes componentes adicionales, en la mezcla de bisulfito, en las documentos de patente internacional WO 1 / 98 528 y WO 2 / 31 186, o en Paulin, R. et al., Nucleic Acids Res 26 (1998) 59 - 51.

Los equipos a modo de "kit", para realizar tratamientos con bisulfito, se encuentran comercialmente...

1. Procedimiento para la conversión de una base de citosina, en un ácido nucleico, a una base de uracilo, que comprende las etapas de

a) incubar una solución que comprende el ácido nucleico, durante un período de tiempo de 1,5 a 3,5 horas, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes comprendidos entre 7 y 9°C, en donde, la concentración de bisulfito, en la solución, es de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 3 M y 6,25 M, y en donde, el valor de pH de la solución, es de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 5,25 y 5,75, en donde, el ácido nucleico, se desamina, y

b) incubar la solución que comprende el ácido nucleico desaminado, en condiciones alcalinas, a cuyo efecto, el ácido nucleido desaminado, se desulfona.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, en la etapa a), la temperatura, es de valor comprendido entre 75 y 85°C.

3. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por el hecho de que, la concentración de bisulfito, es de un valor comprendido entre 3,2 M y 6 M.

4. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que el periodo de tiempo se encuentra comprendido entre 1,75 horas y 3 horas.

5. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que, el período de tiempo, se encuentra comprendido entre 2 horas y 3 horas.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que, en la etapa a), la temperatura, es de 8°C, la concentración de bisulfito, es 5 M, el valor de pH de la solución, es de 5,5 y, el período de tiempo, se encuentra comprendido entre 2 y 3 horas.