Medio de reacción para la detección y/o la identificación de bacterias del género Legionela.

Medio de reacción para el cultivo, la detección y/o la identificación de bacterias del género Legionella,

que comprende al menos un compuesto siliciado, caracterizado por que dicho compuesto siliciado es una sílice apolar.

Medio de reacción para la detección y/o la identificación de bacterias del género Legionela La presente invención se refiere a un medio de reacción para las legionelas, así como a la utilización de tal medio, y a un procedimiento que utiliza este medio.

Las legionelas (Legionela sp) son unas bacterias del entorno hídrico (ecosistemas naturales y redes de distribución de aguas) susceptibles de provocar unas infecciones, a veces mortales en el ser humano. Se han puesto en evidencia varias especies del género Legionela en el ser humano, pero la más importante es la Legionela pneumophila (L. pneumophila) , responsable de aproximadamente el 90% de los casos de legionelosis. Otras especies, tales como L. jordanis están generalmente aisladas en unos sujetos inmunodeprimidos. La legionelosis (o enfermedad del legionario) es una enfermedad respiratoria caracterizada por una neumopatía aguda severa, cuya infección es adquirida por la inhalación de aerosoles contaminados por la Legionela, como las torres de refrigeración, los sistemas de climatización, los establecimientos termales, las duchas, etc. Después de un periodo de incubación de 2 a 10 días, los pacientes presentan un síndrome pseudogripal. Aparece después una fiebre elevada, una pleuresía, una tos importante, asociadas a trastornos gastrointestinales (diarrea, vómitos) incluso a veces neurológicos (delirio, somnolencia, confusión) . En 2005, se señalaron más de 1500 casos en Francia y aproximadamente 5700 en Europa; en los Estados Unidos, el CDC (Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades) estima que habría de 8000 a 18000 casos de legionelosis al año.

El diagnóstico de la legionelosis es muy complejo ya que la enfermedad es atípica: clásica de una neumopatía, no tiene nada específico. La mortalidad es del 20% de los casos de media, más bien bajo en los casos comunitarios pero sin embargo, importante en los casos nosocomiales. Un diagnóstico precoz es esencial para proponer al paciente un tratamiento adecuado.

El diagnóstico se puede realizar según los métodos siguientes:

- la identificación mediante un método de inmunofluorescencia directa. Realizado sobre la extracción con anticuerpos de los principales serogrupos de L. pneumophila, este método permite la puesta en evidencia de los antígenos solubles. Los métodos utilizados principalmente son ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) , la RIA (análisis por radioinmunología) o ICM (inmunocromatografía sobre membrana) . El mayor inconveniente de estas técnicas es que permiten detectar sólo la presencia eventual de ciertos serogrupos de L. pneumophila.

- el diagnóstico serológico de los anticuerpos anti-antígeno O de LPS por inmunofluorescencia indirecta. Este método permite identificar sólo L. pneumophila serogrupo 1 y presenta el riesgo de numerosos falsos positivos debidos a las reacciones cruzadas con las micobacterias, las leptospiras, Chlamydia, Mycoplasma, Pseudomonas, Flavobacterium, etc.

- la identificación bacteriológica mediante el método de cultivo. El crecimiento de las legionelas es difícil. En efecto, no se cultivan sobre gelosas con sangre, el pH debe ser estrictamente controlado (6, 9 +/-0, 2) y se deben cumplir las exigencias de la bacteria. Así, los cultivos se realizan generalmente sobre una gelosa BCYE (Extracto de Levadura con Carbón Tamponado) suplementada en tampón ACES, en L-cisteína, y en Fer; siendo estos dos últimos elementos unos factores de crecimiento indispensables; o GVPC. Las colonias son observables a partir de 48h de incubación a 37ºC. La identificación de las legionelas se puede realizar en medio Legionela GVPC (bioMérieux) , que es un medio específico y selectivo que favorece el aislamiento de la mayoría de las especies de Legionela, en particular L. pneumophila. Este medio permite una inhibición del crecimiento de las bacterias Gram positivas, de la mayoría de las bacterias Gram negativas, de las levaduras y de los mohos, gracias a una mezcla optimizada de tres antibióticos.

Sin embargo, los medios de cultivo actuales contienen carbón activado para adsorber los compuestos tóxicos producidos por las Legionelas, o presentes en el medio (extracto de levadura, agar, etc.) o por tratamiento en autoclave del medio de cultivo que genera la formación de radicales libres, también tóxicos para las legionelas. Estos medios son, por lo tanto, de un color negro, que los hace inadecuados para la incorporación de sustratos enzimáticos cromógenos o fluorescentes, que podrían sin embargo facilitar la lectura del medio.

La invención se propone resolver los problemas del estado de la técnica presentando un nuevo medio de reacción para las bacterias del género Legionela.

De manera sorprendente, los inventores han puesto en evidencia que la utilización de compuestos siliciados en un medio de reacción permitía una detección rápida y fácil de las Legionela.

Antes de presentar la invención, se dan las definiciones siguientes para permitir entender mejor la invención. No son de ninguna manera limitativas.

Por "medio de reacción", se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la expresión de un metabolismo y/o para el crecimiento de microorganismos tales como las legionelas.

El medio de reacción puede ser sólido, semisólido o líquido. Por medio sólido, se entiende por ejemplo un medio gelificado. El agar es el agente gelificante tradicional en microbiología para el cultivo de los microorganismos, pero es posible utilizar Gelrite, gelatina, agarosa u otros gelificantes naturales o artificiales. El medio de reacción según la invención debe permitir el crecimiento de las legionelas.

El medio de reacción puede comprender uno o más elementos en combinación, tales como unos aminoácidos, unos hidratos de carbono, unos nucleótidos, unos minerales, unas vitaminas, etc.

El medio puede comprender asimismo un colorante. A título indicativo, se puede citar como colorante el azul de Evans, el rojo neutro, un opacificante tal como el óxido de titanio, la nitroanilina, el verde malaquita, el verde brillante, uno o más indicadores metabólicos, uno o más reguladores metabólicos, etc.

El medio de reacción puede ser un medio de cultivo, un medio de revelación o un medio de cultivo y de revelación. En el caso de un medio de revelación, el cultivo de los microorganismos se efectúa antes de la inoculación y, en el segundo caso, el medio de revelación constituye asimismo el medio de cultivo.

El experto en la materia puede también utilizar una placa de doble compartimento, que permite comparar fácilmente dos medios, que comprende diferentes sustratos o diferentes mezclas selectivas, en los que se depositará una misma muestra biológica.

Por mezcla selectiva, se entiende una mezcla de compuestos que permiten el cultivo selectivo de microorganismos particulares. En el ámbito de la presente invención, la mezcla selectiva puede permitir el cultivo selectivo de las legionelas. Tal medio de cultivo comprende en particular los siguientes compuestos: Glicina, Sulfato de polimixina B, Vancomicina o cefamandol, Cicloheximida, o Anisomicina, o también natamicina, solos o en combinación.

El medio selectivo puede permitir también el cultivo selectivo de algunas especies de legionelas, como por ejemplo L. pneumophila. En este caso, la mezcla selectiva comprende en particular los compuestos siguientes: glicina, Sulfato de polimixina B, Vancomicina o cefamandol, Cicloheximida, Anisomicina, natamicina, púrpura de Bromocresol, azul de Bromotimol solos o en combinación.

Por compuesto siliciado, se entiende cualquier compuesto que contiene el elemento silicio. Se puede citar de manera no limitativa las zeolitas naturales o sintéticas, las arcillas, de manera preferida la illita, la montmorillonita y preferiblemente la sepiolita, o también las sílices apolares.

Por sílice apolar, se entiende una o más partículas de sílice en las que se ha injertado unas funciones químicas apolares, lo más frecuentemente unas cadenas alquiladas que tienen al menos 2 átomos de carbono. Preferiblemente, tienen de 4 a 24 átomos de carbono, aún más preferiblemente 18 átomos de carbono (octadecilo) , 8 (octilo) o 4 átomos de carbono (butílico) .

Preferiblemente, esta sílice apolar es una octadecil-sílice o una octil-sílice.

Por sustrato enzimático, se entiende una molécula que puede ser metabolizada por una enzima, en un producto que permite la detección, directa o indirecta de un microorganismo. Puede tratarse de sustrato natural o sintético. El metabolismo del sustrato provocará una variación de las propiedades fisicoquímicas del medio de reacción o de las células de organismos.... [Seguir leyendo]

1. Medio de reacción para el cultivo, la detección y/o la identificación de bacterias del género Legionella, que comprende al menos un compuesto siliciado, caracterizado por que dicho compuesto siliciado es una sílice apolar. 5

2. Medio de reacción según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración en sílice apolar está comprendida entre 0, 01 y 100 g/l, preferiblemente entre 1 y 5 g/l.

3. Medio de reacción según una de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además un sustrato enzimático 10 fluorógeno o cromógeno.

4. Medio de reacción según la reivindicación 3, en el que dicho sustrato enzimático fluorógeno o cromógeno es un sustrato de oxido-reductasa o de hidrolasa.

5. Medio de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una mezcla selectiva que permite el cultivo selectivo de bacterias del género Legionella.

6. Utilización de un medio de reacción que comprende al menos un compuesto siliciado que es una sílice apolar, para el cultivo, la detección y/o la identificación de bacterias del género Legionella. 20

7. Utilización según la reivindicación 6, de un medio de reacción en el que la concentración en compuesto siliciado está comprendida entre 0, 01 y 100 g/l, preferiblemente entre 1 y 5 g/l.

8. Utilización según una de las reivindicaciones 6 ó 7, de un medio de reacción que comprende además un sustrato 25 enzimático fluorógeno o cromógeno.

9. Utilización según la reivindicación 8 de un medio de reacción en el que dicho sustrato enzimático fluorógeno o cromógeno es un sustrato de oxido-reductasa o de hidrolasa.

10. Utilización según una de las reivindicaciones 6 a 9, de un medio de reacción que comprende además una mezcla selectiva que permite el cultivo selectivo de bacterias del género Legionella.

11. Procedimiento de detección y/o de identificación de bacterias del género Legionella, que comprende las etapas siguientes: 35

a. poner en contacto una muestra susceptible de contener unas bacterias del género Legionella con un medio de reacción según una de las reivindicaciones 1 a 5;

b. incubar, y 40

c. detectar la presencia de bacterias del género Legionella.