PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE INOSITOLES FOSFATO Y SU ADAPTACIÓN COMO KIT.

Procedimiento para la determinación de inositoles fosfato y su adaptación como kit.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de inositoles fosfato en muestras biológicas y que comprende las siguientes etapas: poner en contacto la muestra con un intercambiador iónico sólido usando una técnica estática de baño; aislar el intercambiador iónico sólido del resto de muestra sin reaccionar; extraer el inositol fosfato retenido sobre el intercambiador iónico; y detectar el inositol fosfato extraído. Además comprende el procedimiento de detección del inositol fosfato y un kit para llevar a cabo cualquiera de dichos procedimientos.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE INOSITOLES FOSFATO Y SU ADAPTACIÓN COMO KIT

La presente invención se refiere a un método para la determinación de inositoles fosfato en muestras preferentemente biológicas y su adaptación como kit. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la química analítica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La determinación de inositoles fosfato en matrices biológicas (orina, plasma, tejidos) es un problema real que en la actualidad representa un campo de investigación muy amplio.

Uno de los inositoles fosfato que más se ha investigado es el inositol hexafosfato. En la literatura se encuentran descritos una amplia variedad de métodos para el análisis de inositol hexafosfato, en general de tipo cromatográfico, aunque la mayoría de ellos se han desarrollado para su aplicación a la determinación del inositol hexafosfato en alimentos. Los métodos actuales para la cuantificación de inositol hexafosfato pueden ser indirectos o directos, independientemente de que sean cromatográficos o no- cromatográficos.

Los métodos indirectos pueden a su vez subclasificarse en:

1. Aquellos en los que se hidroliza la molécula, pudiendo cuantificar el inositol liberado [1] o bien el fosfato [2].

2. Métodos basados en la capacidad del inositol hexafosfato para acomplejar iones metálicos. Se fundamentan en el uso de una reacción paralela en la que se forma un compuesto que presenta alguna característica detectable con los detectores habituales (p.ej. fotometría) [3-4]. Concretamente, utilizan como metal el Fe(III) y su formación de complejos coloreados con ácido sulfosalicílico

[3] o con tiocianato [4].

3. También puede cuantificarse la molécula sin ninguna reacción previa a la detección, cuantificando el fósforo de la misma mediante plasma acoplado inductivamente [5] o por resonancia magnética nuclear de 31P [6].

Los métodos directos más usados incluyen la espectrometría de masas, conductimetría o refractometría, entre otros métodos, aunque en todos ellos se requiere de una elevada pureza de la muestra, por lo que implican tiempos prolongados de análisis.

Sin embargo, son muy pocas las metodologías no-cromatográficas que se han podido aplicar con éxito a matrices biológicas debido a la elevada complejidad de las mismas. En esas matrices, la baja concentración de inositol hexafosfato, la baja sensibilidad, la incapacidad para detectar el compuesto o la falta de robustez del método deja pocas alternativas, y las que hay implican reacciones de hidrólisis o de derivatización, o bien el uso de técnicas de análisis que requieren una instrumentación complicada y costosa poco accesible en el análisis clínico de rutina.

March y col. [2] describen la determinación indirecta de inositol hexafosfato en orina. La metodología aplicada implica:

- purificación previa de la orina mediante uso de una columna con carbón activo

- purificación del inositol hexafosfato con una columna con resina de intercambio aniónico

- el inositol hexafosfato se extrae con una solución de ácido sulfúrico

- hidrólisis del inositol hexafosfato por calor en microondas

- determinación del fosfato liberado por fotometría con azul de molibdeno

Sin embargo, este método realiza la purificación de la muestra mediante extracción en fase sólida (SPE) en formato de columna y la concentración de inositol hexafosfato en la muestra purificada no experimenta ningún aumento respecto a la muestra original. Además, la detección aún cuando es de tipo colorimétrico, requiere la hidrólisis previa del inositol hexafosfato lo que

prolonga el tiempo de análisis.

Otra publicación de March y col. [7], también aplicable a la determinación de inositol hexafosfato en orina previa purificación de la misma mediante dos procesos consecutivos de SPE, determina el inositol hexafosfato fluorimétricamente mediante una reacción en la que el inositol hexafosfato activa la oxidación de la hidrazona de la 2-2-dipiridilcetona.

Finalmente, otras publicaciones (March y col. [8], Perello y col. [9] y Grases y col. [5]) en las que se determina inositol hexafosfato en orina, comparten la purificación mediante SPE con las publicaciones indicadas anteriormente, pero difieren en la detección del inositol hexafosfato que se realiza por técnicas no fotométricas.

Es de destacar que en ninguno de los métodos aplicados a la determinación de inositol hexafosfato en orina se purifica la molécula mediante el uso un absorbente en fase sólida utilizando la técnica "estática" o de baño, usando en todos ellos la técnica de columna.

Tampoco, en ninguno de los métodos más cercanos al estado de la técnica se consigue preconcentrar la molécula significativamente, tal y como ocurre en la presente invención, ya que o bien la muestra purificada contiene una concentración igual de inositol hexafosfato a la de la muestra original o incluso esa concentración es menor. Solamente en el documento [9] se consigue un factor de preconcentración de 1,7x. Este hecho es fundamental, pues la aplicabilidad de un método fotométrico o fluorimétrico para la cuantificación de inositoles fosfato en matrices biológicas tiene como requisito una preconcentración significativa debido a la limitada sensibilidad intrínseca de las técnicas, por lo que el procesamiento (la purificación/preconcentración) de la muestra es un factor claramente diferencial.

Referencias

1. March, JG.; Simonet, BM.; Grases, F. Determination of phytic acid by gas chromatography-mass spectroscopy: application to biological samples. J Chromatogr B 2001, 757, 247-255.

2. March, JG.; Simonet, BM.; Grases, F.; Salvador, A. Indirect determination of phytic acid in uriñe. Anal Chim Acta 1998, 367, 63-68

3. Latta, M.; Eskin, M. A simple and rapid colorimetric method for phytate determination. J. Agrie. Food Chem. 1980 28, 1313-1315.

4. Talamond P, Gallón G, Guyot JP, Mbome Lape I, Tréche S. Comparison of High-Performance Ion Chromatography and absorptiometric methods for the determination of phytic acid in food samples. Analusis 1998 26, 396-400

5. Grases, F.; Perello, J.; Isern, B.; Prieto, R. M. Determination of myo-inositol hexakisphosphate (phytate) in uriñe by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Anal. Chim. Acta 2004, 510, 41-43.

6. Mazzola, EP.; Phillippy, B.Q.; Harland, BF.; Miller, TH.; Potemra, JM.; Katsimpiris, EM. Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectroscopic determination of phytate in foods, J. Agrie. Food Chem. 1986, 34, 60-62.

7.- March, J.G. Simonet, B.M. Grases F. Fluorimetric determination of phytic acid based on the activation of 2,2'-diphyridyl ketone hydrazone catalised by Cu(ll). Analyst, 1999, 124, 897-900.

8.- Perello, J.; Isern, B.; Muñoz, J. A.; Valiente, M.; Grases, F. Determination of phytate in uriñe by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry, Chromatographia 2004, 60, 265 -268.

9.- Grases, F.; Perello, J.; Isern, B.; Prieto, R. M. Determination of myo-inositol hexakisphosphate (phytate) in uriñe by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Anal. Chim. Acta 2004, 510, 41-43.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método no-cromatográfico sensible, sencillo y rápido para la determinación fotométrica de inositoles fosfato, que además pueda ser aplicado en forma de kit para el análisis de inositoles fosfato.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento no- cromatográfico para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de un inositol fosfato en muestras biológicas y que comprende las siguientes etapas:

i) Poner en contacto la muestra con un intercambiador iónico sólido usando una técnica estática de baño; preferiblemente se ponen en contacto en un recipiente durante 5 minutos como mínimo;

ii) Aislar el intercambiador iónico sólido del resto de muestra sin reaccionar;

iii) opcionalmente lavar el intercambiador iónico sólido;

iv) Extraer el inositol fosfato retenido sobre el intercambiador iónico sólido obtenido en la etapa (ii) o (iii), preferiblemente utilizando una disolución de un ácido o una sal; preferiblemente en varias etapas y conduciendo a una concentración de la muestra inicial en un factor superior a 2x;

v) opcionalmente concentrar el extracto durante la etapa anterior, obteniendo un residuo seco, para mejorar la sensibilidad del procedimiento;

vi) opcionalmente efectuar una hidrólisis del extracto obtenido en la etapa (iv) o bien a partir de una disolución concentrada o residuo seco en la etapa (v); y

ix) detectar el inositol fosfato... [Seguir leyendo]

1.- Un procedimiento no-cromatográfico para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de un inositol fosfato en muestras biológicas y que comprende las siguientes etapas:

i) Poner en contacto la muestra con un intercambiador iónico sólido usando una técnica estática de baño;

ii) Aislar el intercambiador iónico sólido del resto de muestra sin reaccionar;

iii) opcionalmente lavar el intercambiador iónico sólido;

iv) Extraer el inositol fosfato retenido sobre el intercambiador iónico sólido obtenido en la etapa (ii) o (iii), preferiblemente utilizando una disolución de un ácido o una sal; preferiblemente en varias etapas y conduciendo a una concentración de la muestra inicial en un factor superior a 2x;

v) opcionalmente concentrar el extracto durante la etapa anterior para mejorar la sensibilidad;

vi) opcionalmente efectuar una hidrólisis del extracto obtenido en la etapa (iv) o bien a partir de una disolución concentrada de la etapa (v); y

ix) detectar el inositol fosfato extraído en la etapa (iv) o concentrado en la etapa (v) o su producto de hidrólisis obtenido en la etapa (vi).

2.- El procedimiento según vindicación 1, donde se efectúa adicionalmente una dilución de la muestra biológica previamente a la etapa (i), preferiblemente la dilución se lleva a cabo con agua, más preferiblemente se diluye la muestra como mínimo 1/2 (muestra/diluyente).

3.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde se efectúa adicionalmente un ajuste del pH de la muestra biológica previamente a la etapa (i), preferiblemente en el rango 1 a 6, más preferiblemente entre 2 y 4,5.

4.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la muestra se selecciona entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo,

orina, heces o extractos de tejidos.

5.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el intercambiador iónico sólido es una resina de intercambio aniónico, preferiblemente la resina de intercambio aniónico se selecciona de la lista que comprende AG1-X2, AG1-X4, AG1-X8, AG4-X4, Dowex 1X2, Dowex 1X4, Dowex 1X8, SAX y WAX, más preferiblemente la resina es AG1-X8.

6.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la cantidad de intercambiador iónico sólido está preferiblemente entre 0,2 g y 0,3 g respecto a 10 mL de muestra.

7.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde en la etapa (i) la muestra y el intercambiador iónico se ponen en contacto en un recipiente durante 5 minutos como mínimo.

8.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde en la etapa (ii) se aísla el intercambiador iónico sólido mediante el uso de un recipiente con un desagüe que presenta una frita, que evita que pase la fase sólida, y preferiblemente que contenga una llave de paso.

9.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde en la etapa (iii) el intercambiador iónico sólido se lava con un volumen adecuado de HCI, preferiblemente HCI 50 mM.

10.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde en la etapa (vi) se extrae el inositol fosfato retenido sobre el intercambiador iónico sólido con una disolución de un ácido o una sal, preferiblemente se extrae con NaCI 2 M, más preferiblemente usando un volumen de disolución inferior o igual al 25% del volumen de muestra usado.

11.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la

detección en la etapa (ix) se realiza mediante colorimetría, preferiblemente el inositol fosfato a determinar se derivatiza haciéndolo reaccionar con un complejo metal-compuesto cromógeno que se puede seleccionar de la lista que comprende Zn-zincón, Al-Lumogalion, Y-Piridilazo resorcinol y Fe-tiocianato.

12.- Un procedimiento para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de un inositol fosfato que comprende la detección mediante fotometría donde el inositol fosfato se derivatiza haciéndolo reaccionar con un complejo metal- compuesto cromógeno seleccionado lista que comprende: Zn-zincón; Al- Lumogalion; Y-Piridilazo resorcinol junto con un tampón a un pH de 6 a 11 y un surfactante; y Fe-tiocianato, junto con un tampón a un pH de 1 a 6 y un agente oxidante.

13.- El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde el inositol fosfato es inositol hexafosfato.

14.- Un kit para llevar a cabo el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende:

a) Una disolución de un ácido y/o una sal;

b) Un intercambiador iónico sólido;

c) Un reactivo o conjunto de reactivos para la formación de un compuesto coloreado con el inositol fosfato (hidrolizado o no) y/o un reactivo o conjunto de reactivos para la formación de un compuesto coloreado que será destruido por el inositol fosfato; y

d) un recipiente con un desagüe que presenta una frita, que evita que pase la fase sólida, y preferiblemente que contiene una llave de paso.

15.- Uso del kit descrito según la reivindicación 14, para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de inositol fosfato, más preferiblemente inositol hexafosfato.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

N.° solicitud:

Fecha de presentación de la solicitud: 02.01.2012 Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

© Int. Cl.: G01N33/48 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados

Rei vi nd icaciones afectadas

BARTLETT G. R. "Isolation and assay of red-cell inositol polyphosphates." Analytical Biochemiestry (1982) Vol. 124, páginas 425-431. Resumen, página 425-427.

GRASES F., MARCH J.G., PRIETO R. M SIMONET B. M., COSTA-BAUZÁ A., GARCÍA-RAJA A., y CONTE A. "Urinary phytate in calcium oxalate stone formers and healthy people." Scandinavian Journal of Urology and Nephrology (2000) Vol. 34, páginas 162-164.

Todo el documento.

WANG N., HATCHER D. W., TYLER R. T., TOEWS R., GAWALKO E. J. "Effect of cooking on the composition of beans (Phaseolus vulgaris L.) and chickpeas (Cicer arietinum L.) Food Research International (2010) Vol. 43, páginas 589-594. Página 590, columna 2.

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Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud

E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud