Kit y método para la identificación de la bacteria causante de la tiña de las uñas.

Kit de identificacion para la identificacion de los hongos causantes de la tina ungueal usando PCR en tiempo real,

que comprende un conjunto de cebadores y sondas,

en el que el conjunto de cebadores es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y un cebador que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO: 2, y un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO: 3 y un cebador que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO: 4, y

en el que las sondas comprenden una sonda que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO: 5 y una sonda que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Kit y método para la identificación de la bacteria causante de la tiña de las uñas

Campo técnico

La presente invención se refiere a un kit y a un método para la identificación de los hongos causantes de la tiña ungueal (dermatofitosis de la uña) , usando PCR en tiempo real.

Técnica anterior La tiña ungueal está provocada por una infección fúngica de las uñas en más del 90% de los casos y, cuando es grave, conduce a una alteración de la coloración de las uñas a blanco o marrón amarillento, engrosamiento y separación del lecho de la uña. Existen varios hongos causantes de la tiña ungueal, la mayoría de los cuales son de dos especies, Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes (documento no de patente 1) . El tratamiento de la tiña ungueal emplea fármacos antifúngicos orales tales como terbinafina, itraconazol y griseofulvina, y fármacos antifúngicos tópicos tales como fármacos a base de imidazol, a base de alilamina, a base de bencilamina y a base de ácido tiocarbámico. Sin embargo, la tiña ungueal es generalmente más difícil de curar que la tiña del pie (dermatofitosis del pie) o la tiña corporal (dermatofitosis del cuerpo) , y un problema particular es que los fármacos antifúngicos tópicos existentes tienen una baja eficacia. Con el fin de mejorar el efecto curativo para la tiña ungueal, es esencial identificar rápidamente los hongos causantes y seleccionar de manera precisa un agente antifúngico.

Los métodos para el diagnóstico de la tiña, incluyendo la tiña ungueal, incluyen examen microscópico directo con KOH en el que se toma una muestra de la zona afectada de la uña o cutícula y se observa bajo un microscopio para confirmar la presencia o ausencia de elementos fúngicos, y métodos de cultivo en los que se cultiva la muestra durante varias semanas en un medio selectivo y se identifican las especies fúngicas observando la microestructura de colonias o células. Sin embargo, el diagnóstico mediante examen microscópico directo con KOH requiere destreza y básicamente no permite la identificación de especies fúngicas. Por otro lado, los métodos de cultivo permiten la identificación de especies fúngicas pero requieren largos periodos de tiempo, tales como varias semanas, tienen tasas de cultivos positivos bajas y requieren destreza para la identificación morfológica.

Otro método de diagnóstico para la tiña es, por ejemplo, uno en el que ARNm de actina de dermatofitos extraído de la lámina ungueal de un paciente con tiña ungueal se cuantifica mediante PCR en tiempo real y se intenta detectar el hongo de la tiña y estimar su volumen (documento no de patente 2) . Sin embargo, este método no es conveniente desde el punto de vista de la manipulación porque la diana de detección es ARNm.

Como aún otro método de diagnóstico que permite una detección precisa de los hongos causantes de la enfermedad fúngica de la uña, se ha dado a conocer un método en el que se llevan a cabo una primera PCR y una PCR anidada (documento de patente 1) . Sin embargo, este método requiere electroforesis y no es adecuado para el tratamiento de grandes cantidades de espécimen.

Lista de documentos citados Bibliografía de patentes [Documento de patente 1] Publicación de solicitud de patente japonesa no examinada n.º 2008-067605

Bibliografía no de patente [Documento no de patente 1] Nishimoto, S.: Shinkinshi (Japanese Journal of Medical Mycology) 47:103-111, 2006

[Documento no de patente 2] Tsuboi, R.: Rinpi (Japanese Journal of Clinical Dermatology) 57 (5) :94-97, 2003

Bergmans et al. (Clinical Microbiology And Infection 16 (6) :704-710, 2009) dan a conocer una PCR en tiempo real en un solo tubo para la detección e identificación de 11 especies de dermatofitos en material clínico.

Sumario de la invención Problema técnico La PCR en tiempo real puede usarse para la detección de virus y organismos patógenos. La PCR en tiempo real es un método en el que se llevan a cabo una amplificación de ADN mediante PCR y una detección del producto de amplificación mediante fluorescencia simultáneamente usando un dispositivo que integra tanto un termociclador como un detector de fluorescencia. El método es ventajoso porque no requiere confirmación del producto de amplificación mediante electroforesis, permitiendo obtener resultados de manera conveniente y rápida, y también tiene un riesgo bajo de contaminación. Sin embargo, hasta la fecha no existe ningún método para la detección e identificación sensibles y cuantitativas de los hongos causantes de la tiña ungueal mediante PCR en tiempo real.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un kit y un método para la identificación de los hongos

causantes de la tiña ungueal, que permite una identificación rápida y precisa de un hongo causante mediante PCR en tiempo real usando un conjunto de cebadores y una sonda específicos para una especie fúngica.

Solución al problema Como resultado de una investigación concienzuda dirigida hacia solucionar los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores han encontrado que pueden identificarse de manera rápida y precisa los hongos causantes de la tiña ungueal mediante PCR en tiempo real usando un conjunto de cebadores y sondas específicos para la región ITS1 en el ADN ribosómico de los hongos causantes de la tiña ungueal, y han completado esta invención.

Específicamente, la invención proporciona un kit de identificación para la identificación de los hongos causantes de la tiña ungueal usando PCR en tiempo real, que comprende un conjunto de cebadores y sondas, en el que el conjunto de cebadores es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2, y un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, y en el que las sondas comprenden una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 5 y una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Con un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2, es posible amplificar la longitud completa de la región ITS1 de ADN ribosómico (aproximadamente 350 pb) que es universal para los hongos, y con un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4 es posible amplificar específicamente una parte de la región ITS1 de ADN ribosómico (aproximadamente 150 pb) de los principales hongos causantes, Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.

Con una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 5, es posible detectar específicamente la región ITS1 de ADN ribosómico de Trichophyton mentagrophytes, y con una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 6 es posible detectar específicamente la región ITS1 de ADN ribosómico de Trichophyton rubrum.

Por tanto, con un kit de identificación de la invención es posible identificar de manera rápida y precisa Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes, que son los principales hongos causantes de la tiña ungueal.

La invención también proporciona un método para identificar los hongos causantes de la tiña ungueal, que comprende una etapa de extraer ADN total de una muestra de uña tomada de un sujeto, una etapa de preparar un conjunto de cebadores y sondas específicos para la región ITS1 de ADN ribosómico de un hongo causante de la tiña ungueal, y una etapa de amplificar la región ITS1 de ADN ribosómico de los hongos causantes de la tiña ungueal a partir del ADN total extraído usando PCR en tiempo real mediante el conjunto de cebadores, al tiempo que se detecta simultáneamente el ADN amplificado mediante las sondas, e identificar las especies fúngicas. Según el método de identificación de la invención, es posible identificar de manera rápida y precisa hongos causantes de la tiña ungueal.

En el método de identificación de la invención, el conjunto de cebadores es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conjunto de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta... [Seguir leyendo]

1. Kit de identificación para la identificación de los hongos causantes de la tiña ungueal usando PCR en

tiempo real, que comprende un conjunto de cebadores y sondas,

en el que el conjunto de cebadores es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conjunto de

cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID

NO: 1 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2, y un conjunto

de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID

NO: 3 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, y

en el que las sondas comprenden una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ

ID NO: 5 y una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

2. Método para identificar los hongos causantes de la tiña ungueal, que comprende:

una etapa de extraer ADN total de una muestra de uña tomada de un sujeto,

una etapa de preparar un conjunto de cebadores y sondas específicas para la región ITS1 de ADN

ribosómico de un hongo causante de la tiña ungueal, y

una etapa de amplificar la región ITS1 de ADN ribosómico del hongo causante de la tiña ungueal a partir del

ADN total extraído usando PCR en tiempo real mediante el conjunto de cebadores, al tiempo que se

detecta simultáneamente el ADN amplificado mediante las sondas, e identificar las especies fúngicas;

en el que el conjunto de cebadores es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conjunto de

cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID

NO: 1 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2, y un conjunto

de cebadores que consiste en un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID

NO: 3 y un cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, y

en el que las sondas comprenden una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ

ID NO: 5 que se hibrida específicamente con la región ITS1 en ADN ribosómico de Trichophyton

mentagrophytes, y una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 6 que

se hibrida específicamente con la región ITS1 en ADN ribosómico de Trichophyton rubrum.