Kit para predecir el éxito de implantación en fertilización asistida.

Kit para determinar en un sujeto del sexo femenino la posibilidad de implantación de embriones obtenidos o a ser obtenidos mediante fertilización asistida,

que comprende:

- Medios para medir, para una pluralidad de oocitos recogidos de dicho sujeto, el nivel de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) presentes en el fluido folicular (FF) de un folículo de cada oocito recogido, estos medios comprendiendo al menos un reactivo adecuado para la detección de los niveles de mRNA de FF G-CSF o de FF G-CSF, y

- Una pluralidad de puntas aspiradoras desechables para extraer los oocitos individuales y el correspondiente fluido folicular del sujeto.

Kit para predecir el éxito de implantación en fertilización asistida

La fecundación asistida, tal como la fecundación in vitro (FIV) o la inyección ¡ntracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) se han usado con éxito en pacientes humanos con problemas de infertilidad durante tres décadas. A pesar de la amplia investigación, aún es un procedimiento difícil y caro y normalmente se observa una baja tasa de implantación por embrión transferido (del 15-20%).

Los hospitales y centros privados que proporcionan un servicio de fecundación asistida basan su selección después de la fecundación del oocito en características del embrión así producido. Por ejemplo, la selección puede basarse en la morfología del embrión (Guerlf F et al., 2007, Hum Reprod 22 (7): 1973), o en la producción de HLA-G soluble por parte de los embriones (Fuzzl B, et al., 2002, Eur J Immunol. Feb; 32 (2): 311-5). Ambas técnicas requieren interferencia con el embrión. La función del factor estimulante de colonias de granulocltos (G-CSF) en el ciclo 15 menstrual humano está descrito, por ejemplo, en A. Salmassl et al, Human Reproductlon Vol. 20, No 9, p. 2434-2440 (2005); Salmassi A et al: "Success of COH and IVF correlated wlth granulocyte-colony-stlmulatlng factor", Human Reproduction (Oxford), vol. 21, no. Supl. 1, Junio 2006, página 1159; Yanagl K et al: "Cycllc changes of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) mRNA in the human folllcle durlng the normal menstrual cycle and immunolocalization of G-CSF proteln.", Human Reproductlon (Oxford), vol. 17, no. 12, diciembre 2002, páginas 20 3046-3052; y Salmassi Ali et al: "Detection of granulocyte colony-stimulating factor and ¡ts receptor ¡n human follicular luteinized granulosa cells.", Fertility And Sterility, vol. 81, no. Supl. 1, Marzo 2004 (2004-03), páginas 786- 791. G-CSF puede jugar un papel como predictor del resultado del IVF humano. Se describen métodos de detección de G-CSF en, por ejemplo, Giavedonl L D: "Simultaneous detection of múltiple cytoklnes and chemoklnes from nonhuman primates using luminex technology", Journal Of Immunologlcal Methods, vol. 301, no. 1-2, Junio 2005, 25 páginas 89-101, y Wang J: "Proteomlc identification of ¡nflammatory markers ¡n cerebrosplnal fluid from ¡nfectlous and non - infectious human braln dlseases.", Society For Neurosclence Abstract Vlewer And Itlnerary Planner, vol. 2003, 2003.

Para incrementar el éxito de los embarazos, el número de embriones transferidos habltualmente es más de uno. En 30 Europa es una práctica habitual transferir dos embriones a la cavidad uterina. En Estados Unidos este número es mayor, normalmente se transfieren tres o cuatro embriones. El efecto negativo de tal política es que aumenta el número de embarazos múltiples y las subsiguientes patologías obstétricas relacionadas, tales como prematuridad y baja tasa de nacimiento principalmente.

Además, la fecundación asistida es un procedimiento caro y puede ser también psicológicamente traumático para un paciente. Se requieren procedimientos quirúrgicos para recoger óvulos para la fecundación asistida y después de la fecundación se requiere otra cirugía para implantar los óvulos fecundados en el útero. La receptora debe entonces esperar un periodo de tiempo antes de que se pueda determinar si el embarazo se ha establecido o no. En algunos casos, el embarazo puede no establecerse nunca a pesar de múltiples intentos y estos casos representan un gasto 40 considerable a la sociedad, en términos tanto financieros como humanos.

Por tanto, sería deseable proporcionar un ensayo que pueda indicar el potencial para la implantación de un oocito antes de la fecundación, haciendo posible que se maximicen las probabilidades de implantación satisfactoria del embrión, y permitiendo que se usen indicaciones de tasas bajas de éxito para evitar el trauma y los costes 45 anteriormente mencionados de la fecundación asistida.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Curva ROC de un experimento Luminex para detectar G-CSF LF usando un kit Luminex de Biorad. La tasa 50 de positivo auténtico (Sensibilidad) se representa en función de la tasa de falso positivo (100-Especificidad) para distintos puntos de corte de concentración de G-CSF-LF. Cada punto en la representación ROC representa un par sensibilidad/especificidad que corresponde a un umbral de decisión específico. El área bajo la curva ROC es una medida de lo bien que G-CSF-LF puede distinguir entre dos grupos de diagnóstico principales (implantación segura / sin implantación). Línea 1: El área bajo la curva es 0,82, lo que indica que un individuo seleccionado aleatoriamente 55 del grupo positivo tiene un valor de ensayo mayor que el de un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo negativo el 82% de las veces. Línea 2: el área bajo la curva ROC es 0,5, representando la hipótesis nula.

FIG. 2. Curva ROC de un experimento Luminex para detectar G-CSF LF usando un kit Luminex de R and D. Línea 3: El Área bajo la curva es 0,72, lo que indica que un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo positivo tiene un valor de ensayo mayor que el de un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo negativo un 72% de las veces. 60 Línea 4: El Área bajo la curva ROC es 0,5 representando la hipótesis nula.

FIG. 3. Gráfica que muestra la variación en concentración de líquido folicular individual de una misma cohorte de embriones obtenidos de múltiples sujetos. Cada caja muestra la variación de líquidos foliculares individuales con respecto a la media en una misma cohorte de embriones generada.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en un descubrimiento inesperado de los inventores de que un sujeto del sexo femenino que proporciona una pluralidad de oocitos bajo hiperestimulación ovárica exhibirá una variación en los niveles de varias 5 citoquinas y factores de crecimiento presentes en el líquido folicular del folículo del que deriva cada oocito. Además, los inventores descubrieron que hay una fuerte correlación entre un alto nivel de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) presente en el líquido folicular del folículo individual del que deriva un oocito y un alto potencial de implantación de un embrión obtenido por fecundación de dicho oocito. Nunca se ha demostrado antes que, para el mismo sujeto, el líquido folicular que rodea cada oocito individual puede variar en composición y que dicha 10 composición es indicativa del éxito de implantación del oocito fecundado posteriormente. Este descubrimiento permite clasificar una pluralidad de embriones obtenidos de una única paciente en orden de potencial de implantación. Por primera vez puede descubrirse que pacientes que muestran un potencial de fertilidad límite usando indicadores que hacen una media de marcadores de fertilidad de oocitos (por ejemplo 11-beta HSD) tienen oocitos que muestran un alto potencial de implantación frente a una media global pobre; esto ofrece nuevas 15 posibilidades para mujeres que previamente tenían indicios de infertilidad. Además, el método ofrece la posibilidad de valorar cada oocito individualmente y por lo tanto el embrión individualmente, sin interferencia con el embrión u oocito.

La presente invención se refiere a un kit de ensayo que se puede usar para predecir el resultado de la fertilización 20 asistida en una paciente femenina. Dicho ensayo y kit se pueden usar en un método de tratamiento de fertilización para mejorar la implantación.

La presente invención se define mediante un kit y uso de un kit según se describe en las reivindicaciones 1 a 11.

En el presente documento también se describe un ensayo para determinar en un sujeto del sexo femenino las posibilidades de implantación de embriones obtenidos o a ser obtenidos mediante fertilización asistida, que

comprende:

(i) medir, para una pluralidad de oocitos recogidos de dicho sujeto, el nivel de factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) en fluido folicular presente en el fluido folicular (FF) de un folículo de

cada oocito recogido; y

(ii) determinar a partir de los niveles de FF G-CSF medidos, las posibilidades de implantación de los embriones obtenidos o a ser obtenidos mediante fertilización asistida de los oocitos.

Los oocitos que tienen niveles más elevados de FF G-CSF pueden tener las mayores probabilidades de 35 implantación.

Cada muestra de FF se puede obtener de un aspirado folicular.

Los niveles respectivos de FF G-CSF se pueden medir dentro de las 20 horas de la recogida del aspirado folicular.

Un nivel de FF-CSF igual o inferior a 20.6 pg/ml puede determinar una probabilidad baja o nula de implantación.

Un nivel de FF-CSF igual o superior a 24.0 pg/ml puede determinar... [Seguir leyendo]

1. Kit para determinar en un sujeto del sexo femenino la posibilidad de implantación de embriones obtenidos o a ser 5 obtenidos mediante fertilización asistida, que comprende:

Medios para medir, para una pluralidad de oocitos recogidos de dicho sujeto, el nivel de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) presentes en el fluido folicular (FF) de un folículo de cada oocito recogido, estos medios comprendiendo al menos un reactivo adecuado para la detección de los niveles de mRNA de 10 FF G-CSF o de FF G-CSF, y

Una pluralidad de puntas aspiradoras desechables para extraer los oocitos individuales y el correspondiente fluido folicular del sujeto.

2. Kit de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un conjunto de patrones de concentración de FF 15 G-CSF.

3. Kit de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho reactivo incluye anticuerpos contra FF G-CSF opcionalmente unidos a una etiqueta.

4. Kit de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho reactivo incluye los de un kit de Biorad o R y D Luminex.

5. Kit de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho reactivo incluye sondas nucleicas para la detección de mRNA de FF G-CSF.

6. Uso de un kit que comprende al menos un reactivo adecuado para la detección de niveles de mRNA de FF G-CSF o de FF G-CSF, y una pluralidad de puntas aspiradoras para extraer un oocito individual y el correspondiente fluido folicular de un sujeto, para un ensayo de determinación en un sujeto del sexo femenino de la posibilidad de implantación de los embriones obtenidos o a ser obtenidos mediante fertilización asistida, que comprende las etapas

de:

(i) medir, para una pluralidad de oocitos recogidos de dicho sujeto, el nivel de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) presentes en el fluido folicular (FF) de un folículo de cada oocito recogido, y

(ii) determinar a partir de los niveles de FF G-CSF las posibilidades de implantar los embriones obtenidos o a ser 35 obtenidos mediante fertilización asistida de los oocitos.

7. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además un conjunto de patrones de concentración de FF G-CSF.

8. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en donde dicho reactivo incluye anticuerpos contra FF G- CSF unidos opcionalmente a una etiqueta.

9. Uso de un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicho reactivo incluye los de un kit Biorad o R y D Luminex.

10. Uso de un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde dicho reactivo incluye sondas nucleicas para la detección de mRNA de G-CSF.

11. Uso de un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un ensayo para determinar en un 50 sujeto del sexo femenino la posibilidad de implantación de embriones obtenidos o a ser obtenidos mediante

fertilización asistida.