INMUNOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL.

Inmunosensor electroquímico para la determinación de deoxinivalenol.

La presente invención se refiere a un kit que comprende un inmunosensor electroquímico para la determinación cuantitativa del deoxinivalenol (DON). Se trata de un inmunosensor electroquímico competitivo directo, donde se utilizan anticuerpos específicos de la micotoxina DON inmovilizados sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G. DON procedente de la muestra a analizar competirá con un DON marcado con peroxidasa de rábano picante por un elemento de biorreconocimiento, que es el anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre las partículas magnéticas. La etapa de la reacción enzimática y la detección electroquímica tienen lugar sobre un electrodo múltiple, preferiblemente de 8 electrodos serigrafiados de carbono, detectándose electroquímicamente los electrones generados tras la reacción enzimática. Además, la invención se refiere al método de detección y cuantificación electroquímico de la micotoxina DON utilizando el kit y a su uso para la detección y cuantificación en cereales y productos derivados.

La presente invención se refiere a un kit que comprende un inmunosensor electroquímico 5 para la determinación de deoxinivalenol (DON).

Además, la invención se refiere al método de detección y cuantificación electroquímico de la micotoxina DON utilizando el kit y a su uso para la detección y cuantificación en cereales y productos derivados.

Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la química analítica y/o química 10 de los alimentos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El deoxinivalenol (DON) es uno de los 150 compuestos perteneciente al grupo de los tricotecenos de tipo B, junto a nivalenol, y las toxinas H-2 y HT-2, tricotecenos de tipo A. Es una micotoxina que tiene la capacidad de inhibición de síntesis proteica eucariótica y la 15 síntesis de DNA y RNA, afecta al sistema inmunitario, y se encuentra en cereales como trigo, avena y maíz. El intervalo de concentraciones permitidas es de entre 200 y 1750 ng/g.

El DON es uno de los tricotecenos más polares, por lo que es soluble en agua y en disolventes polares como metanol o acetonitrilo, lo que facilita su extracción. Posee, a diferencia de otros tricotecenos, un grupo carbonilo conjugado que le otorga cierta 20 absorbancia molecular en el UV y que puede utilizarse para seleccionar su bio- reconocimiento o su separación por cromatografía líquida de alta eficacia (en inglés High performance liquid chromatography HPLC).

El comité científico de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria EFSA (del inglés European Food Safety Authority) considera crítica su toxicidad e inmunotoxicidad, por lo que 25 establece una ingesta máxima diaria TDI (del inglés Tolerable Dayly Intake) de 1 pg/Kg b.w. Empleando técnicas analíticas que permitan determinar concentraciones del orden de 5 ng/g, puede encontrarse una frecuencia de alrededor del 50% en cereales.

La toma de conciencia de la Unión Europea sobre el problema de la toxicidad e

inmunotoxicidad de DON en cereales va encaminada hacia el control de los productos

contaminados, los modos de transformación de los alimentos y sobre su comercialización y etiquetado, por medio de organismos como la EFSA, la Oficina Alimentaria y Veterinaria FVO (del inglés Food and Veterinary Office ) y la Oficina Comunitaria de las Variedades Vegetales CPVO (del inglés Community Plant Variety Office). Estas disposiciones comunitarias son de directa aplicación en España, y son adoptadas directamente por la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición AESAN.

La presencia de esta micotoxina en alimentos es un problema que hace necesaria una reglamentación estricta y unos laboratorios acreditados para su detección y análisis que empleen métodos analíticos validados. Los resultados de diversos proyectos de investigación de los estados miembros de la UE han contribuido en gran medida al desarrollo de métodos analíticos estándar y a la disponibilidad de estándares de calibración de alimentos para esta micotoxina.

Los métodos desarrollados para la detección y determinación de deoxinivalenol (DON), generalmente suelen emplear técnicas tales como la cromatografía en capa fina, cromatografía en capa fina de alta resolución, cromatografía líquido-líquido de alta resolución, cromatografía de gases y métodos de inmunoensayo ELISA. También se han empleado varias técnicas de espectrometría de masas (EM) con este fin. La mayoría de métodos analíticos de determinación de DON incluyen columnas de extracción en fase sólida o columnas de afinidad para la eliminación de la matriz, que están combinadas con cromatografía de gases y detectores de captura electrónica o espectrometría de masas, o bien están combinadas con cromatografía líquida de alta resolución y detección fluorescente o detección de absorción en el UV.

El DON puede extraerse de cereales con mezclas de agua con metanol o acetonitrilo, y presenta absorción en el UV aunque su medida espectrofotométrica no es muy sensible. Métodos como cromatografía de capa fina y HPLC presentan por este motivo baja sensibilidad, por lo que lo más frecuente es emplear cromatografía de gases usualmente acoplada a la espectrometría de masas. Sin embargo, al tratarse de una molécula que no es volátil, previamente al uso de la cromatografía de gases es necesario derivatizarlo en una molécula que sí pueda determinarse por esta técnica.

También es posible la determinación electroquímica indirecta de algunos tricotecenos de tipo B, como el DON, después de su liberación mediante hidrólisis a pH básico a 80 °C durante 1 h., siendo la sensibilidad de DON de 9,1 pM en un rango lineal 0,32 a 32 mg/Kg.

Los métodos de inmunoensayo ELISA con detección espectrofotométrica son comúnmente empleados en los análisis rutinarios, aunque generalmente sólo se usan para confirmar la presencia o la ausencia de niveles máximos de micotoxinas en alimentos. La sensibilidad y especificidad de un método ELISA depende en su mayor parte de la naturaleza, del origen y de las propiedades de los anticuerpos usados. En general, la exactitud de los análisis depende de la naturaleza de la micotoxina a determinar, del procedimiento de preparación de la muestra y de la naturaleza de la matriz, por lo que una separación preliminar al inmunoensayo ELISA permite mejorar la exactitud y reproducibilidad de la determinación. Las autoridades internacionales imponen unos límites de cuantificación de los métodos analíticos validados de alrededor de 0,73 pg/Kg de DON. Los inmunoensayos ELISA son muy sensibles, tienen límites de detección de hasta 0,025 pg/l), además son específicos y rápidos.

Aunque algunos ensayos ELISA tienen sensibilidades comparables con los métodos instrumentales de cromatografía líquida de alta resolución con detección de absorción en el UV, sin embargo, debido a la reactividad cruzada del anticuerpo con la matriz y las interacciones no selectivas con otras micotoxinas de la misma clase, existe el riesgo de obtener falsos positivos. También existe el riesgo de obtener falsos resultados negativos por la sensibilidad inadecuada del inmunoensayo, por lo que finalmente sería necesario confirmar con cualquier resultado del inmunoensayo con cromatografía líquida de alta resolución con detección de absorción en el UV. La disponibilidad y especificidad de anticuerpos de DON se ha aprovechado también en otras técnicas analíticas muy prometedoras. La determinación selectiva de DON mediante biosensores específicos se basa en el uso de anticuerpos monoclonales y policlonales como elementos de bio- reconocimiento, que suelen tener bajos porcentajes de reactividad cruzada y son los mejores candidatos como elementos sensores. Recientemente se han publicado un inmunosensor electroquímico amperométrico para la determinación de DON, y otro de impedancia electrónica. Estos inmunosensores electroquímicos se basan en los mismos principios que los inmunoensayos ELISA, aunque la inmovilización del anticuerpo o antígeno tiene lugar sobre la superficie del transductor electroquímico. En la comparación del esquema ELISA competitivo directo o indirecto para la determinación de DON, el formato directo proporcionó resultados comparables el menor límite de detección y el rango analítico requerido para la determinación de DON en harinas.

Por tanto, para superar todos los problemas técnicos de sensibilidad mencionados es necesario el desarrollo de nuevos métodos analíticos para la determinación cuantitativa de

DON.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un kit que comprende un inmunosensor electroquímico para la determinación cuantitativa del deoxinivalenol (DON). Se trata de un inmunosensor 5 electroquímico competitivo directo, donde se utilizan anticuerpos específicos de la micotoxina DON inmovilizados sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G. Además, la invención se refiere al método de detección y cuantificación electroquímico de la micotoxina DON utilizando el kit y a su uso para la detección y cuantificación en cereales y productos derivados.

Los anticuerpos específicos de DON no han sido modificados en la invención, por lo que el biorreconocimiento es muy alto en este inmunosensor.

La funcionalización de las micropartícula magnéticas de la invención con proteína G es la forma más adecuada de orientar la región Fe de unión al anticuerpo de DON hacia el antígeno.

El tamaño de estas partículas magnéticas, de entre 2,5 a 3 pm, hace que aumente el número de anticuerpos específicos del DON que se pueden unir a la partículas magnéticas, por lo que la densidad de grupos Fe que pueden unirse al antígeno también es mayor.

El deoxinivalenol procedente... [Seguir leyendo]

1. Kit que comprende un anticuerpo monoclonal de la micotoxina deoxinivalenol DON inmovilizado sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas por proteína G, un conjugado DON-HRP que comprende la micotoxina DON unida a una enzima peroxidasa de rábano picante HRP, un sustrato y un cosustrato enzimáticos de dicha enzima HRP que comprende hidroquinona y peróxido de hidrógeno, disolución tampón y un inmunosensor electroquímico que comprende un potenciostato portable, un electrodo múltiple, un soporte y un sistema de imanes.

2. El kit, según la reivindicación 1, donde el anticuerpo monoclonal DON inmovilizado sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas por proteína G está en forma de suspensión en disolución tampón.

3. El kit, según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo monoclonal DON tiene una concentración de entre 0,6 y 10 mg/l.

4. El kit, según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo monoclonal DON tiene una concentración de 5 mg/l.

5. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el conjugado DON-HRP que comprende la micotoxina DON unida a una enzima peroxidasa de rábano picante HRP está diluido en la disolución tampón en una proporción seleccionada de entre 1 a 10, 1 a 8 y 1 a 5.

6. El kit, según la reivindicación anterior, donde el conjugado DON-HRP está diluido en la disolución tampón en una proporción de 1 a 5.

7. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la cantidad de micropartículas magnéticas necesarias está en un rango comprendido entre 5 a 20 pg.

8. El kit, según la reivindicación anterior, donde la cantidad de micropartículas magnéticas necesarias está en un rango comprendido entre 10 a 15 pg.

9. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde las micropartículas magnéticas tienen un diámetro de entre 2,5 pm y 3 pm.

10. El kit, según la reivindicación anterior, donde las micropartículas magnéticas tienen un diámetro de 2,8 pm.

11. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la disolución tampón es una disolución fosfato salina que se selecciona de la lista que comprende PBS, PBST o cualquiera de sus combinaciones.

12. El kit, según la reivindicación anterior, donde la disolución tampón está a una concentración de 0,1 M.

13. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 11 u 12, donde la disolución tampón se encuentra a un pH de entre 6.5 y 7.5.

14. El kit, según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 13 donde el soporte se selecciona de la lista que comprende una placa de microvaloración ELISA o soporte de plástico o cuentas.

15. Un método para determinar y cuantificar electroquímicamente la micotoxina DON en una muestra utilizando el kit, según las reivindicaciones 1 a 14, que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra a analizar, diluida en disolución tampón, con una disolución de un conjugado enzimático DON-HRP que comprende la micotoxina DON unida a una enzima peroxidasa de rábano picante HRP,

b) añadir una suspensión del anticuerpo monoclonal de DON inmovilizado sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G en disolución tampón sobre la disolución obtenida en la etapa a),

c) agitar y aplicar un campo magnético mediante un sistema de imanes,

d) añadir la suspensión de la etapa c) sobre un electrodo múltiple, preferiblemente de 8 electrodos serigrafiados de carbono,

e) añadir una disolución de un sustrato y cosustrato enzimáticos de la enzima HRP que comprende hidroquinona y peróxido de hidrógeno, sobre la suspensión de la etapa d),

f) realizar la medida electroquímica.

16. El método, según la reivindicación anterior, donde la muestra a analizar procede de muestras de cereales o productos derivados.

17. El método, según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, donde las etapas (a), (b) y (c) se llevan a cabo en un soporte seleccionado de la lista que comprende una placa de microvaloración ELISA o soporte de plástico o cuentas.

18. El método, según la reivindicación anterior, que se lleva a cabo en una placa de microvaloración ELISA.

19. El método, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde la medida electroquímica es una medida amperométrica.

20. El método, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, donde la etapa (f) se realiza a un potencial reductor de -0.35V.

21. Uso del kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para determinar y cuantificar

la micotoxina DON en cereales y sus productos derivados.