Identificación y aislamiento de células multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral.

Una población celular aislada sustancialmente homogénea pasada de forma consecutiva que comprende células adultas multipotentes,

que (a) se han aislado a partir de tejido adiposo, (b) expresa CD9, CD10, CD13, CD29, CD44,CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105; y (c) carece de la expresión de CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

Identificación y aislamiento de células multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral Campo de la invención

La presente invención se refiere a una población celular aislada sustancialmente homogénea pasada de forma consecutiva que comprende células adultas multipotentes que se han aislado a partir de tejido adiposo y están caracterizadas por la presencia o ausencia de un conjunto de marcadores de superficie.

Antecedentes de la invención

Las células madre presentan como características diferenciales el ser células capaces de automantenerse y de diferenciarse a uno o más tipos celulares. Aunque las investigaciones sobre las células madre y sus aplicaciones se encuentran en una fase inicial, las células madre adultas presentes en la médula ósea han sido utilizadas en trasplantes durante más de 30 años. No obstante, en los últimos años la tecnología de las células madre ha experimentado un Importante desarrollo que ha hecho que, en la actualidad, sean consideradas como una prometedora fuente de tejidos y órganos, presentando un Importante potencial terapéutico en la reparación y regeneración de tejidos.

El uso de células madre constituye una terapia alternativa para diversas patologías humanas, en especial, en aquellas en que existe una pérdida de células funcionales, incluyendo: lesiones condrales, óseas y musculares, enfermedades neurodegenerativas, rechazo inmunológlco, enfermedades cardíacas y desórdenes de la piel (ver los números de patente US 5.811.094, US 5.958.767, US 6.328.960, US 6.379.953, US 6.497.875).

Además de las aplicaciones en terapia celular, las células madre presentan potenciales aplicaciones en la investigación y desarrollo de nuevos fármacos. Por una parte, el estudio de los mecanismos implicados en la proliferación y diferenciación de las células madre tiene un gran valor en el proceso de búsqueda y caracterización de nuevos genes involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación celular y los procesos neoplásicos (Phillips et al., 2000; Ramalho-Santos et al., 2002; Ivanova et al., 2002). Por otra parte, la tecnología de las células madre permite la generación de tipos celulares especializados y el desarrollo de modelos celulares de enfermedades humanas y animales, en los que poder determinar la eficacia y toxicidad de nuevos principios activos en fase preclínica (ver patente US 6.294.346).

Una célula madre somática adulta es una célula indiferenciada que se halla en un tejido diferenciado y que presenta capacidad de proliferación y de diferenciación a uno o más tipos celulares. Las células madre adultas están presentes en diversos tejidos adultos, encontrándose ampliamente descrita su presencia en médula ósea, sangre, córnea, retina, cerebro, músculo, esqueleto, pulpa dental, epitelio gastrointestinal, hígado y piel (Jiang etal., 2002). Por su naturaleza, las células madre adultas pueden usarse en un entorno autólogo, y como tales, son inmunocompatibles y su uso no presenta impedimentos de tipo ético.

Una célula madre adulta debe ser capaz de dar lugar a células totalmente diferenciadas que presenten fenotipos maduros y se integren en el tejido en el que se encuentran, siendo capaces de realizar aquellas funciones especializadas propias de dicho tejido. El término fenotipo, se refiere a las características observables de la célula: morfología característica, interacciones con otras células y con la matriz extracelular, proteínas de la superficie celular (marcadores de superficie) y funciones características.

Se han descrito diversas poblaciones de células madre adultas capaces de contribuir a la reparación de distintos tejidos. Entre dichas poblaciones, las de origen mesodérmico tienen un especial interés, pues ofrecen la posibilidad teórica de regenerar un gran número de tejidos conectivos clínicamente muy relevantes, tales como: hueso, cartílago, tendones, músculo esquelético, músculo cardiaco, endotelio vascular, grasa subdérmica y estroma medular. La primera población celular aislada de este tipo fueron las llamadas células madre mesenquimales (MSC), contenidas en el estroma de la médula ósea (Friedenstein et al., 1976; Caplan et al., 1991; Pittenger et al., 1999). Estas células han sido extensamente caracterizadas y estudios realizados en las mismas han demostrado que pueden diferenciarse a distintos linajes celulares mesenquimales, tales como: adipocitos (Beresford et al., 1992), condrocitos (Johnstone et al., 1998), mioblastos (Wakitani et al., 1995) y osteoblastos (Haynesworth et al., 1992). Asimismo, presentan también capacidad de diferenciación a neuronas (Sánchez-Ramos et al., 2000).

La fuente ideal de células madre adultas es aquella en que el proceso de obtención es fácil, no invasivo y permite el aislamiento de un número de células suficientemente alto. En particular, una fuente de células madre que permita que puedan ser fácilmente aisladas de un sujeto vivo sin que esto implique riesgos o molestias significativas y que permita obtener un rendimiento elevado con una contaminación mínima por otros tipos celulares, sin que el coste del aislamiento y cultivo sea excesivo.

El proceso de obtención de médula ósea es doloroso y el rendimiento es muy bajo, siendo necesario un incremento importante del número de células, mediante su expansión ex vivo, para obtener una cantidad clínicamente relevante. Dicho paso implica un coste, a nivel económico y de tiempo, así como un mayor riesgo de contaminación y de pérdida de material. Por estas razones, sería muy deseable el poder aislar células multipotentes a partir de tejidos

mesenquimales distintos de la médula ósea. En particular, dada su accesibilidad quirúrgica, sería muy conveniente aislar dichas células a partir de tejidos mesodérmicos no osteocondrales, tales como, pero sin limitarse a: dermis, grasa y músculo esquelético.

La presencia de diversas poblaciones de células madre multipotentes en tejidos blandos derivados del mesodermo embrionario, ha sido descrita por varios autores. Así, por ejemplo, se ha descrito la obtención de células multipotentes a partir de músculo esquelético y otros tejidos conectivos de mamíferos (Young et al. 1993, Rogers et al. 1995). También han sido obtenidas células multipotentes a partir de tejidos llpoasplrados humanos (Zuk et al., 2001). El documento WO/022988 A2 da a conocer células madre derivadas de tejido adiposo y fracciones enriquecidas con células madre derivadas de tejido adiposo, así como su capacidad para diferenciarse a distintos linajes celulares. Otro ejemplo de células multipotentes aisladas de tejidos conectivos adultos, lo constituyen las llamadas Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC obtenidas a partir de médula ósea (Jiang et al., 2002). En principio, todas estas poblaciones celulares aisladas podrían ser utilizadas en la reparación y regeneración de tejidos conectivos de forma similar a las MSC de médula ósea (Caplan et al., 2001). Sin embargo, salvo las MAPC, ninguna de estas poblaciones ha sido, hasta la fecha, suficientemente caracterizada a nivel fenotípico. Por tanto, aunque ha sido descrita la presencia de células adultas multipotentes en diversos tejidos conectivos, en el estado actual de la técnica no es posible identificar y distinguir entre sí de manera inequívoca distintos tipos de poblaciones celulares multipotentes obtenidas a partir de tejidos blandos, ni obtener una población sustancialmente pura.

En la actualidad, la caracterización fenotípica de células madre comprende la determinación de marcadores, tales como receptores de la superficie celular, entre otros; y la determinación de su capacidad de diferenciación en cultivo in vitro. Cada tipo celular presenta una determinada combinación de marcadores en su superficie, es decir, presenta un perfil de expresión determinado que caracteriza dicho tipo celular distinguiéndolo de otros.

Diferentes combinaciones de marcadores de superficie han sido utilizados para identificar y aislar poblaciones sustancialmente puras de células madre hematopoyéticas de médula ósea de ratones, como: [Linne9,low, Thy1.1low, c-Kithigh, Sca-1+], [Lin , Thy1.íow, Sca-1+, rhodamine 123low] (Morrison, S.J. et al., 1995) o [Un, CD34',int, c-Kit+, Sca-1+] (Osawa, M. et al., 1996). Asimismo, combinaciones similares de marcadores se han utilizado para enriquecer poblaciones de células madre hematopoyéticas humanas [Lin', Thy1+, CD34+, CD38ne9,l0W] (Morrison, S.J. et al., 1995).

Actualmente, no se conoce cuantos marcadores asociados con células comprometidas y diferenciadas se encuentran también presentes en las distintas poblaciones de células mesenquimales adultas multipotentes. Por ejemplo, un marcador comúnmente... [Seguir leyendo]

1. Una población celular aislada sustancialmente homogénea pasada de forma consecutiva que comprende células adultas multlpotentes, que (a) se han aislado a partir de tejido adiposo, (b) expresa CD9, CD10, CD13, CD29, CD44.CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105; y (c) carece de la expresión de CD11b, CD14,

CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

2. Una población de células adultas multlpotentes según la reivindicación 1, que se aísla mediante un método que comprende:

(a) recolección del tejido adiposo;

(b) obtención de una suspensión celular mediante digestión enzlmátlca;

(c) sedimentación de las células y resuspensión en un medio de cultivo; y

(d) cultivo de las células en una superficie sólida y eliminación de las células que no muestran adhesión a dicha superficie sólida

(e) expansión mediante el paso de forma consecutiva de las células.

3. Una composición farmacéutica que comprende una población celular, según las reivindicaciones 1 o 2, y un vehículo 15 farmacéuticamente aceptable.

4. Una población celular aislada según las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en terapia.