Identificación del tropismo celular de virus.

Método in vitro de identificación de microARN, o de sus ARNm diana,

cuya expresión, cuando tiene lugar la infección de células por un virus que utiliza un receptor celular y por lo menos un co-receptor celular para entrar en la célula, es modificada específicamente en función del co-receptor celular utilizado por el virus para su entrada en las células, que comprende:

i) determinar los niveles de expresión de microARN en una célula de prueba, que expresa un receptor, un primer co-receptor y por lo menos otro co-receptor, después de la infección respectivamente por un primer virus que utiliza el primer co-receptor y por lo menos por otro virus que utiliza otro co-receptor;

ii) identificar los microARN cuyo nivel de expresión es modulado cuando tiene lugar la infección por cada uno de los virus con respecto al nivel de expresión en unas células no infectadas;

iii) comparar los microARN así identificados;

iv) seleccionar los microARN cuya modificación del nivel de expresión es específica de la utilización de un coreceptor;

v) eventualmente identificar los ARNm diana de los micro-ARN así seleccionados.

de ia Invención

El término "miARN" o "mlcroARN" se refiere a una clase de ARN, generalmente de 20 a 25 nucleótidos de largo, Implicados en la regulación post-transcripcional de algunos genes específicos degradando o bloqueando la traducción del ARNm procedente de la transcripción de estos genes. Por "ARNm diana" de un miARN, se entiende un ARNm del cual se sabe o del cual se ha determinado que está degradado, o cuya traducción está bloqueada por dicho miARN. Los miARN están descritos en particular en Griffiths-Jones ((2004) Nucleic Acids Res 32:D109-D111), en Griffiths-Jones ef a/. ((2008) Nucleic Acids Res 36:D154-D158) y en la base de datos sobre los miARN (miRBase, http://mlcroARN.sanger.ac.uk ).

La expresión "virus" tal como se utiliza en la presente memoria comprende todos los tipos de virus. En particular, el virus se puede seleccionar de entre el grupo de los virus cuyas vanantes o especies son más o menos patógenas, por ejemplo los retrovirus, en particular el virus VIH, los virus de la gripe, los coronavirus, los virus de la rubeola, los herpesvirus (Incluyendo los virus EBV, Simplex y CMV), los papilomavirus. Preferentemente, el virus es un retrovirus seleccionado de entre los retrovirus humanos, en particular VIH, HTLV-I y XMRV. Aún más preferentemente, el virus es el VIH y en particular los virus VIH-1 y VIH-2 (descritos en particular en la base de datos H/V databases, http://www.hlv.lanl.gov/content/lndex ). SI el virus según la invención es el VIH, los virus utilizados para realizar las Infecciones pueden, por ejemplo, ser unos virus prototipos, como los virus VIH-1, NL4.3, VIH-2 ROD o VIH-1 NLAD8 o unos virus de un paciente. Los virus VIH según la Invención pueden utilizar uno o varios co-receptores para entrar en las células diana. Preferentemente, en los métodos de Identificación de micro-ARN según la invención, los virus VIH utilizados utilizan un solo tipo de co-receptor para entrar en una célula.

El término "paciente" designa un ser humano Infectado por un virus. Preferentemente, el virus es el VIH. El paciente puede entonces eventualmente haber desarrollado un SIDA (Síndrome de Inmuno-Deficiencia Adquirida). Eventualmente, el paciente está bajo tratamiento antl-retrovlral, por ejemplo bajo tratamiento HAART (tratamiento antl-retrovlral altamente activo ("Highly Active Antl-Retrovlral Therapy").

Los términos "receptor" y "receptor celular" según la Invención designan una estructura de superficie celular, en general una proteína, que Interviene en el reconocimiento de una célula diana por un virus y conduce generalmente a la fijación de este virus a la célula diana. Los términos "co-receptor" y "co-receptor celular" agrupan el conjunto de las proteínas celulares de superficie que participan en la entrada del virus, con la exclusión del receptor celular.

Cuando el virus es el VIH, los términos "co-receptor" y "co-receptor celular" agrupan más específicamente el conjunto de las proteínas celulares de superficie que participan en la entrada del virus, además de la Interacción entre el virus y el receptor celular CD4. La entrada de un virus VIH en una célula hospedante Implica la fusión entre las membranas celular y viral. En particular, el co-receptor se puede seleccionar de entre el grupo constituido por CXCR4, CCR5, CCR3, CCR2, CCR1, CCR4, CCR8, CCR9, CXCR2, STRL33, V28, gpr1, gpr15 y ChemR23. Preferentemente, el co-receptor es CCR5 o CXCR4.

CXCR4 es también conocido bajo los nombres de Fusln, LESTR y NPY3R. El gen CRCR4 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CXCR4 humano cuya secuencia de ARNm puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 1 o cualquier variante aléllca o pollmórflca de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CXCR4 codifica la proteína CXCR4 que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 2 o cualquier variante natural de ésta.

CCR5 es también conocido bajo los nombres de CKR-5 y CMKRB5. El gen CCR5 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR5 humano cuya secuencia de ARNm puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 3 o cualquier variante aléllca o pollmórflca de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras

especies. El gen CCR5 codifica la proteína CCR5, que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 4 o cualquier variante natural de ésta.

CCR3 es asimismo conocido bajo los nombres de CC-CKR-3, CKR-3 y CMKBR3. El gen CCR3 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR3 humano cuya secuencia de ARNm puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 5 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CCR3 codifica la proteína CCR3 que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 6 o cualquier variante natural de ésta.

CCR2 es también conocido bajo los nombres de CCR2b y CMKBR2. El gen CCR2 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR2 humano cuya secuencia de ARNm puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 7 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CCR2 codifica la proteína CCR2, que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 8 o cualquier variante natural de ésta.

CCR1 es también conocido bajo los nombres de CKR1 y CMKBR1. El gen CCR1 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR1 humano cuya secuencia de ARNm puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 9 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CCR1 codifica la proteína CCR1 que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 10 o cualquier variante natural de ésta.

CCR4 es también conocido bajo el nombre de CKR-4. El gen CCR4 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR4 humana cuya secuencia de ARNm puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 11 o cualquier variante alélica o polimórfica de esta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CCR4 codifica la proteína CCR4, que puede ser de secuencia representada por la SEC ID n° 12 o cualquier variante natural de ésta.

CCR8 es también conocido bajo los nombres de ChemRI, TER1 y CMKBR8. El gen CCR8 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR8 humano cuya secuencia de ARN puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 13 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias otiólogas presentes en otras especies. El gen CCR8 codifica la proteína CCR8 que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 14 o cualquier variante natural de ésta.

CCR9 es también conocido bajo el nombre de D6. El gen CCR9 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CCR9 humano cuya secuencia de ARN puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 15 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CCR9 codifica la proteína CCR9, que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 16 o cualquier variante natural de ésta.

CXCR2 es también conocido bajo el nombre de IL-8RB. El gen CXCR2 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen CXCR2 humano cuya secuencia de ARN puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 17 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen CXCR2 codifica la proteína CXCR2, que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 18 o cualquier variante natural de ésta.

STRL33 es también conocido bajo los nombres de Bonzo, CXCR6 y TYMSTR. El gen STRL33 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen STRL33 humano cuya secuencia de ARN puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 19 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen STRL33 codifica la proteína STRL33, que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n°20 o cualquier variante natural de ésta.

V28 es también conocido bajo los nombres de CMKBRL1, CX3CR1 y GPR13. El gen V28 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen V28 humano cuya secuencia de ARN puede, por ejemplo, ser la SEC ID n° 21 o cualquier variante alélica o polimórfica de ésta, así como las secuencias ortólogas presentes en otras especies. El gen V28 codifica la proteína V28, que puede tener la secuencia representada por la SEC ID n° 22 o cualquier variante natural de ésta.

El gen gpr1 o GPR1 designa en la presente memoria preferentemente la secuencia del gen gpr1 humano, cuya... [Seguir leyendo]

1. Método /n v/fro de identificación de microARN, o de sus ARNm diana, cuya expresión, cuando tiene lugar la infección de células por un virus que utiliza un receptor celular y por lo menos un co-receptor celular para entrar en la célula, es modificada específicamente en función del co-receptor celular utilizado por el virus para su entrada en las células, que comprende:

i) determinar los niveles de expresión de microARN en una célula de prueba, que expresa un receptor, un primer co-receptor y por lo menos otro co-receptor, después de la Infección respectivamente por un primer virus que utiliza el primer co-receptor y por lo menos por otro virus que utiliza otro co-receptor;

¡I) Identificar los microARN cuyo nivel de expresión es modulado cuando tiene lugar la infección por cada uno de los virus con respecto al nivel de expresión en unas células no Infectadas;

¡II) comparar los microARN así Identificados;

¡v) seleccionar los microARN cuya modificación del nivel de expresión es específica de la utilización de un co- receptor;

v) eventualmente Identificar los ARNm diana de los mlcro-ARN así seleccionados.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la célula de prueba expresa un primer y un segundo co-receptores y es infectada por un primer virus que utiliza el primer co-receptor y un segundo virus que utiliza el segundo co- receptor para entrar en la célula.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que los virus son unos retrovirus.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los virus son unos virus VIH.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el co-receptor utilizado por uno de los virus VIH se selecciona de entre el grupo constituido por CXCR4, CCR5, CCR3, CCR2, CCR1, CCR4, CCR8, CCR9, CXCR2, STRL33, V28, gpr1, gpr15 y ChemR23.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el co-receptor utilizado por el primer virus VIH es CXCR4 y el co- receptor utilizado por el segundo virus VIH es CCR5.

7. Método según una de las reivindicaciones 4 a 6, en el que las células de prueba son las células Jurkat-CCR5.

8. Método /n v/fro de identificación de un co-receptor celular utilizado por un virus que utiliza un receptor celular y por lo menos un co-receptor celular para entrar en una célula, en un paciente infectado por el virus, que comprende:

i) poner en contacto una muestra del paciente susceptible de contener el virus con una célula de prueba que expresa un receptor celular del virus y por lo menos un co-receptor celular del virus;

¡i) determinar el nivel de expresión de por lo menos un miARN cuya expresión está específicamente modificada en función del co-receptor celular utilizado por el virus para su entrada en las células y/o de por lo menos un ARNm diana de dicho miARN en la célula de prueba;

i¡¡) comparar el nivel de expresión con un valor predeterminado;

iv) deducir si el virus utiliza o no un co-receptor celular expresado por la célula de prueba.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el valor predeterminado es el nivel de expresión del miARN o del ARNm en una célula de prueba no infectada.

10. Método según la reivindicación 8 o 9, en el que el virus es el virus VIH y en el que la célula de prueba expresa el receptor celular CD4.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la célula de prueba expresa un co-receptor celular seleccionado de entre el grupo constituido por CXCR4, CCR5, CCR3, CCR2, CCR1, CCR4, CCR8, CCR9, CXCR2, STRL33, V28, gpr1, gpr15y ChemR23.

12. Método según la reivindicación 10, en el que la célula de prueba expresa CXCR4.

13. Método según una de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el microARN se selecciona de entre el grupo constituido por hsa-m¡R574-5p, hsa-m¡R-663, hsa-m¡R-149*, hsa-m¡R-575, hsa-m¡R-638, hsa-m¡R-181b, hsa-let-7g,

hsa-m¡R-30a, hsa-m¡R-148a y hsa-m¡R-9*.

14. Método según la reivindicación 13, en el que un aumento de la expresión de por lo menos un microARN seleccionado de entre el grupo que comprende hsa-m¡R574-5p, hsa-m¡R-663, hsa-mlR-149*, hsa-m¡R-575, hsa-m¡R-

5 638 o una disminución de la expresión de por lo menos un microARN seleccionado de entre el grupo que comprende

hsa-m¡R-181b, hsa-let-7g, hsa-m¡R-30a, hsa-m¡R-148a y hsa-m¡R-9* Indica que CXCR4 es un co-receptor utilizado por el virus VIH.

15. Método según una de las reivindicaciones 8 a 14, en el que el nivel de expresión de los microARN o la cantidad 10 de ARNm se mide por RT-PCR o con la ayuda de un microchip.

16. Método según una de las reivindicaciones 10 a 15, en el que las células de prueba se seleccionan de entre el grupo constituido por las células Jurkat y por las células Jurkat-CCR5.