Aislamiento e identificación de glucosaminoglucanos.

Un método para aislar glucosaminoglucanos capaces de unirse con una proteína que tiene un dominio de unión a heparina,

en donde la proteína se caracteriza por o comprende SEC ID Nº: 1, comprendiendo el método:

(i) proporcionar un soporte sólido que tiene moléculas polipeptídicas adheridas al soporte que se caracterizan por, o comprenden, SEC ID Nº: 1;

(ii) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una mezcla que comprende glucosaminoglucanos de modo que se permite la formación de complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(iii) separar los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(v) recoger los glucosaminoglucanos disociados.

Aislamiento e identificación de glucosaminoglucanos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al aislamiento e identificación de glucosaminoglucanos capaces de unirse con proteínas que tienen un dominio de unión a heparina, así como al uso de los glucosaminoglucanos aislados en el crecimiento y/o desarrollo de tejido.

Antecedentes de la invención Los glucosaminoglucanos (GAG) son macromoléculas de carbohidratos complejas responsables de realizar y regular un amplio número de funciones celulares esenciales.

Los GAG se han implicado en la modulación o mediación de muchos sistemas de señalización en concierto con los muchos cientos de factores de crecimiento de unión a heparina y adhesivos conocidos. Se contempla que la asociación de los factores de crecimiento con GAG modula sus diversas actividades con una serie diversa de acciones, tales como alargamiento de sus semividas protegiéndolos de la degradación proteolítica, modulando la localización de estas citocinas en la superficie celular, mediando en interacciones moleculares y estabilizando los complejos de ligando-receptor.

Hay un número cada vez mayor de factores de crecimiento de unión a heparina identificados, añadiéndose a los cientos ya conocidos, la mayoría de los cuales se han modificado por cromatografía de afinidad de heparina. Estos incluyen la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) extensiva, los PDGF y las pleiotropinas hasta la superfamilia de citocinas de TGF-ß. Esta última familia de factores abarca la subfamilia de proteína morfogenética del hueso (BMP) osteo-inductora, llamada así por su capacidad para inducir la formación de hueso ectópico.

La naturaleza y efecto de la interacción de GAG y factores de crecimiento siguen sin estar claros. Aunque se ha mostrado que la interacción entre FGF2 y secuencias de sacáridos particulares halladas dentro de la heparina es de alta afinidad, sigue sin estar claro en general si la asociación entre otros factores de crecimiento y heparán implica una interacción de unión específica o de alta afinidad entre un epítopo de secuencia de aminoácidos en el factor de crecimiento de proteínas y una secuencia de sacárido incluida en el GAG, o si la asociación está mediada por interacciones no específicas, de menor afinidad, entre el GAG y el factor de crecimiento de proteínas.

Si las interacciones entre GAG y proteínas residentes en, o secretadas a, la matriz extracelular son específicas, es necesario identificar los compañeros de unión para determinar las interacciones y entender cómo pueden usarse estas interacciones o modularse para proporcionar nuevos tratamientos.

Una cuestión importante que surge es, por lo tanto, si hay secuencias de sacáridos incluidas en las cadenas de moléculas de GAG que coinciden con secuencias de aminoácidos primarias dentro de la cadena principal polipeptídica de factores de crecimiento controlando de este modo su asociación, y de este modo la bioactividad, con especificidad absoluta, o al menos relativa.

Sumario de la invención

Se ha ideado un método para responder a esta cuestión que implica enriquecer con respecto a moléculas de glucosaminoglucanos que muestran unión con polipéptidos particulares que tienen un dominio de unión a heparina. Después pueden identificarse moléculas y/o mezclas de GAG aislados y ensayarse con respecto a su capacidad para modular el crecimiento y diferenciación de células y tejidos que expresan una proteína que contiene el dominio de unión a heparina. Por primera vez, esto permite el análisis controlado del efecto de secuencias de sacáridos GAG particulares en el crecimiento y diferenciación de células y tejidos, tanto in vitro como in vivo.

En consecuencia, en un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para aislar 55 glucosaminoglucanos capaces de unirse con proteínas que tienen un dominio de unión a heparina/heparán en el que el polipéptido es o comprende SEC ID Nº: 1, comprendiendo el método:

(i) proporcionar un soporte sólido que tiene moléculas polipeptídicas que son, o comprenden, SEC ID Nº: 1 adheridas al soporte, en el que el polipéptido comprende un dominio de unión a heparina;

(ii) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una mezcla que comprende glucosaminoglucanos de modo que se permita la formación de complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(iii) separar los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(v) recoger los glucosaminoglucanos disociados.

En otro aspecto de la presente invención se identifican glucosaminoglucanos aislados por su capacidad para

modular el crecimiento o diferenciación de células o tejidos. Se proporciona un método para identificar glucosaminoglucanos capaces de estimular o inhibir el crecimiento y/o diferenciación de células y/o tejidos, comprendiendo el método:

(i) proporcionar un soporte sólido que tiene moléculas polipeptídicas que son, o comprenden, SEC ID Nº: 1 adheridas al soporte, en el que el polipéptido comprende un dominio de unión a heparina;

(ii) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una mezcla que comprende glucosaminoglucanos de modo que se permita la formación de complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(iii) separar los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(v) recoger los glucosaminoglucanos disociados;

(vi) añadir los glucosaminoglucanos recogidos a células o tejidos en los que está presente una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a heparina;

(vii) medir uno o más de: proliferación de las células, diferenciación de las células, expresión de uno o más 15 marcadores de proteínas.

En realizaciones de la presente invención la mezcla que comprende GAG pueden contener glucosaminoglucanos sintéticos. Sin embargo, en realizaciones preferidas se usan GAG obtenidos de células o tejidos. Por ejemplo, la mezcla puede contener matriz extracelular en la que el material de matriz extracelular se obtiene raspando tejido vivo in situ (es decir directamente del tejido en el cuerpo del ser humano o animal del que se obtiene) o raspando tejido (vivo o muerto) que se ha extraído del cuerpo del ser humano o animal. Como alternativa, el material de matriz extracelular puede obtenerse de células que han crecido en cultivo. El material de matriz extracelular puede obtenerse de tejido conectivo o células del tejido conectivo, por ejemplo hueso, cartílago, músculo, grasa, ligamento o tendón.

El componente de GAG puede extraerse de una muestra tisular o celular o extracto por una serie de etapas de separación rutinarias (por ejemplo cromatografía de intercambio aniónico) , bien conocidas por los expertos en la materia.

Las mezclas de GAG pueden contener una mezcla de diferentes tipos de glucosaminoglucano, que pueden incluir dextrán sulfatos, condroitín sulfatos y heparán sulfatos. En realizaciones preferidas la mezcla de GAG que entra en contacto con el soporte sólido se ha enriquecido con respecto a uno de estos tipos de glucosaminoglucano, más preferentemente con respecto a heparán sulfato. Una fracción de GAG enriquecida con heparán sulfato, condroitín sulfato o dextrán sulfato puede obtenerse realizando cromatografía en columna en la mezcla de GAG, por ejemplo cromatografía de intercambio aniónico débil, medio o fuerte, así como cromatografía líquida de alta presión fuerte (SAX-HPLC) , con selección de la fracción apropiada.

Los GAG recogidos pueden someterse a análisis adicional para identificar el GAG, por ejemplo determinar la composición o secuencia de GAG, o determinar características estructurales del GAG. La estructura del GAG es normalmente altamente compleja, y, teniendo en cuenta las técnicas analíticas disponibles en la actualidad, no son posibles en la mayoría de los casos determinaciones exactas de la estructura de secuencia de GAG.

Sin embargo, las moléculas de GAG recogidas pueden someterse a digestión de sacáridos parcial o completa (por ejemplo químicamente por ácido nitroso o enzimáticamente con liasas tales como heparinasa III) para producir 45 fragmentos de sacáridos que son tanto característicos como diagnósticos del GAG. En particular, la digestión para producir disacáridos (o tetrasacáridos) puede usarse para medir el porcentaje de cada disacárido obtenido que proporcione una "identificación" de disacárido característica del GAG.

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1. Un método para aislar glucosaminoglucanos capaces de unirse con una proteína que tiene un dominio de unión a heparina, en donde la proteína se caracteriza por o comprende SEC ID Nº: 1, comprendiendo el método: 5

(i) proporcionar un soporte sólido que tiene moléculas polipeptídicas adheridas al soporte que se caracterizan por, o comprenden, SEC ID Nº: 1;

(ii) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una mezcla que comprende glucosaminoglucanos de

modo que se permite la formación de complejos de polipéptido-glucosaminoglucano; 10 (iii) separar los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(v) recoger los glucosaminoglucanos disociados.

2. Un método para identificar glucosaminoglucanos capaces de estimular o inhibir el crecimiento y/o la diferenciación 15 de células y/o tejidos, comprendiendo el método:

(i) proporcionar un soporte sólido que tiene moléculas polipeptídicas adheridas al soporte que se caracterizan por, o comprenden, SEC ID Nº: 1;

(ii) poner en contacto las moléculas polipeptídicas con una mezcla que comprende glucosaminoglucanos de 20 modo que se permite la formación de complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(iii) separar los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano del resto de la mezcla;

(iv) disociar los glucosaminoglucanos de los complejos de polipéptido-glucosaminoglucano;

(v) recoger los glucosaminoglucanos disociados;

(vi) añadir los glucosaminoglucanos recogidos in vitro a células o tejidos en los que una proteína que contiene la 25 secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 está presente;

(vii) medir uno o más de: proliferación de las células, diferenciación de las células, expresión de uno o más marcadores proteicos.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2 en el que la mezcla que comprende glucosaminoglucanos contiene 30 material de matriz extracelular.

4. El método de la reivindicación 3 en el que el material de la matriz extracelular deriva de tejido conectivo o de células de tejido conectivo.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la mezcla que comprende glucosaminoglucanos contiene uno o más de un dextrán sulfato, un condroitín sulfato, un heparán sulfato.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la mezcla que comprende glucosaminoglucanos se ha enriquecido con respecto a uno de dextrán sulfato, condroitín sulfato, heparán sulfato. 40

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el método comprende además someter los glucosaminoglucanos recogidos a análisis adicional para determinar las características estructurales del GAG.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los complejos de glucosaminoglucano45 polipéptido se ponen en contacto con una liasa.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el polipéptido comprende además uno o más

aminoácidos adicionales en uno o cada uno de los extremos N y C terminales del polipéptido, en donde el número de dichos aminoácidos adicionales es 1-20.