Genes de Factor VIII y Factor IX modificados y vectores para la terapia génica.

Un gen aislado optimizado modificado para incrementar secuencias de GC y reducir motivos cis con respecto a un gen de FIX de tipo silvestre,

en donde el gen optimizado para FIX tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

Genes de Factor VIII y Factor IX modificados y vectores para la terapia génica Antecedentes de la invención Campo de la invención La invención se relaciona con genes de Factor IX modificados (FIX) , vectores de ácidos nucleicos que incluyen los genes modificados, optimizado cápsidos virales incluyendo los genes modificados; también se divulgan métodos para el uso de los genes modificados en el tratamiento de deficiencias de FIX, tales como la hemofilia A y la hemofilia B.

Discusión de la técnica relacionada La hemofilia es un trastorno de la sangre en el cual la sangre no coagula apropiadamente. La coagulación inadecuada causa sangrado excesivo cuando el hemofílico se lesiona. La hemofilia es un trastorno genético de la coagulación caracterizado por coagulación inadecuada y sangrado excesivo. Varios tipos de hemofilia hereditaria se diferencian por el factor de coagulación afectado. La hemofilia A es causada por una deficiencia en Factor VIII de coagulación sanguínea (FVIII) . La hemofilia B es causada por una deficiencia del Factor IX (FIX) en la coagulación de la sangre.

La hemofilia B es un trastorno enlazado a X y la condición afecta a aproximadamente 1 en 30 000 hombres. En su forma más severa (aproximadamente del 60% de la población de la hemofilia B) la Hemofilia B puede ser fatal. Hemorragias espontáneas en las articulaciones y los músculos puede conducir a una discapacidad permanente.

La terapia génica ha sido propuesta propuesto como modalidad de tratamiento para complementar las deficiencias en los factores de coagulación en hemofílicos. Sin embargo, tal como en muchas áreas de la terapia génica, la teoría es mucho más expedita que la aplicación exitosa y efectiva. Se han encontrado muchas dificultades en los intentos anteriores para diseñar constructos de FVIII y FIX que son adecuados para el tratamiento de los humanos.

Por ejemplo, Manno et al. VAA2 informó administración mediada de FIX para el hígado de sujetos humanos en un estudio en Fase I dando como resultado la expresión de los niveles de FIX biológicamente activos (Manno et al., Blood, (2006) , pp.) . Connelly et al., informó que el tratamiento de ratones deficientes en FVIII con vectores adenovirales que codifican el FVIII humano dieron como resultado la expresión del FVIII humano biológicamente activo (Connelly et al., Blood, Vol. 91, No. 9 (1998) , pp. 3273-3281) . Sarker et al., informó que el uso del serotipo AAV8 en combinación con FVIII corrigió la actividad del FVIII en plasma en modelos de ratón (Sarkar et al., Blood, Vol. 103, No. 4 (2004) , pp. 1253-1260) .

Tanto la US-B-6924365 como la WO-A-02/064799 se relacionan con el ARN mensajero optimizado y divulgan una secuencia sintética de ácido nucleico que codifica una proteína en donde el menos un codón no común o codón menos común es reemplazado por un codón común. La secuencia sintética de ácido nucleico puede incluir un tramo continuo de al menos 90 codones todos los cuales son codones comunes.

A.C. Nathwani, J.T. Gray, Catherine Y.C. Ng, Junfang Zhou, Yunyu Spence, Simon N. Waddington, Edward G.D. Tuddenham, Geoffrey Kemball-Cook, Jenny McIntosh, Mariette Boon-Spijker, Koen Mertens and Andrew M. Davidoff, "Selfcomplementar y adeno-associated virus vectors containing a novel liver-specific human factor IX expression cassette enable highly efficient transduction of murine and nonhuman primate liver", Blood, American Society Of Hematology, US, Vol. 107, No. 7, 1 April 2006, pages 2653-2661, anotan que la transducción con los vectores del virus adeno-asociado recombinante (AAV) está limitada por la necesidad de convertir su genoma de cadena sencilla (ss) a formas de doble cadena (ds) transcripcionalmente activas e informan que, para terapia génica de hemofilia B (HB) mediada por AAV, este obstáculo ha sido superado mediante la construcción de un casete de expresión del factor IX mini-humano (hFIX) restringido al hígado que puede ser empaquetado como dímeros complementarios dentro de partículas de AAV individuales. El análisis molecular de hígado murínico transducido con estos vectores auto-complementarios (sc) demostró rápida formación de genomas lineales de ds activos que persistieron de forma estable como círculos concatámeros o monoméricos, de tal manera que se informó de una mejora de 20 veces en la expresión de hFIX en ratones sobre vectores de ssAAV comparables.

Sin embargo, tal como en muchas áreas de la terapia génica, la teoría es mucho más expedita que la implementación exitosa y efectiva. Las dificultades en la implementación de técnicas de terapia génica incluyen problemas encontrados en el uso de virus como vectores de genes. Mientras que los virus son efectivos como vectores de genes, puesto que pueden ser utilizados para transducir células que conducen a la expresión de proteínas in vivo, las proteínas que recubren la partícula de virus pueden activar el sistema inmune del cuerpo.

Así, existe por lo tanto una necesidad de sistemas que expresen de manera eficiente la proteína objetivo en cantidad suficiente para reducir la dosis requerida del vector viral a niveles tolerables.

Resumen de la invención La presente invención provee genes de Factor IX (FIX) modificado, vectores de ácidos nucleicos que incluyen los genes modificados, cápsidos virales optimizados incluyendo los genes modificados, y el uso de los genes modificados en el tratamiento de deficiencias de FIX, tales como la hemofilia A y la hemofilia B .

En un aspecto, la presente invención provee un gen optimizado aislado modificado para incrementar secuencias CG y reducir los motivos cis con respecto a un gen de FIX de tipo silvestre, en donde el gen optimizado para FIX tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

En otro aspecto, la presente invención provee un vector de virus que comprende el gen optimizado del primer aspecto de la invención. El vector de virus es opcionalmente un vector de virus quimérico que comprende componentes de cápsidos seleccionados de cápsidos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV 5, AAV6, AAV 7 AAV8, AAV9, AAV 10, 11 AAV y AAV12.

Los vectores de virus de la presente invención pueden ser utilizados en métodos para tratar la hemofilia en un sujeto, comprendiendo los métodos:

a. proveer al menos un vector de virus recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un gen de FIX modificado; y

b. administrar el vector de virus recombinante al sujeto bajo condiciones de tal manera que dichas secuencias de nucleótidos de FIX son expresadas a un nivel que produce una cantidad terapéuticamente efectiva del FIX en el sujeto.

La transferencia de genes tiene uso potencial sustancial en la comprensión y el suministro de terapia para estados de enfermedad. Hay una serie de enfermedades hereditarias en las que se conocen y se han clonados los genes defectuosos. En general, los estados de las enfermedades anteriores caen dentro de dos clases: los estados de deficiencia, usualmente de enzimas, que generalmente son heredados de manera recesiva, y los estados de desequilibrio, que pueden involucrar proteínas reguladoras o estructurales, y que son típicamente heredados de manera dominante. Para las enfermedades de estado de deficiencia, la transferencia génica podría usarse para llevar un gen normal en los tejidos afectados para terapia de reemplazo, así como para crear modelos animales para la enfermedad usando mutaciones antisentido. Para estados de desequilibrio de enfermedades, la transferencia génica podría usarse para crear un estado de enfermedad en un sistema modelo, que podría entonces utilizarse en esfuerzos para contrarrestar el estado de enfermedad. Así, los productos de la presente invención permiten el tratamiento de enfermedades genéticas. Tal como se utiliza aquí, un estado de enfermedad se trata remediando parcial o totalmente la deficiencia o desequilibrio que causa la enfermedad o la hace más severa.

Así, las terapias para tratar la hemofilia pueden incluir: terapia génica basada en la administración de secuencia de nucleótidos que codifican genes de FIX optimizados.

En una realización, la presente invención provee un vector de virus quimérico que comprende componentes cápsidos seleccionados de los cápsidos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12 y que incluyen la secuencia del cápsido de AAV2 2.5 (SEQ ID. NO 17) .

En un aspecto todavía adicional, la presente invención contempla un proceso para expresar un péptido FIX optimizado que comprende;

a. transfectar una célula con polinucleótido de SEQ ID NO: 7 que codifica el péptido FIX del mismo para producir una célula anfitriona transformada en donde el polinucleótido ha sido modificado para incrementar... [Seguir leyendo]

1. Un gen aislado optimizado modificado para incrementar secuencias de GC y reducir motivos cis con respecto a un gen de FIX de tipo silvestre, en donde el gen optimizado para FIX tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

2. El gen optimizado de la reivindicación 1, en donde las secuencias de GC se incrementan al menos 40% con respecto al 5 gen de tipo silvestre.

3. El gen optimizado de la reivindicación 1, en donde el gen optimizado está flanqueado por TRs de AAV.

4. Un vector de virus que comprende el gen optimizado de la reivindicación 1.

5. El vector de virus de la reivindicación 4, en donde el vector de virus es un vector de virus quimérico que comprende

componentes del cápsido seleccionados de los cápsidos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 10 AAV10, AAV11 y AAV12.

6. El vector de virus quimérico de la reivindicación 5 que comprende la SEQ ID NO: 17.

7. El vector de virus de la reivindicación 4, en donde el vector de virus comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

8. Un proceso para expresar un péptido FIX optimizado que comprende;

transfectar una célula con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 7 que codifica el péptido FIX del mismo para producir una célula anfitriona transformada, en donde el polinucleótido ha sido modificado para incrementar las secuencias de GC y reducir los motivos cis con respecto a un gen de tipo silvestre; y mantener la célula anfitriona transformada bajo condiciones biológicas suficientes para la expresión del péptido.

9. Una composición farmacéutica que comprende una mezcla de:

un ácido nucleico aislado o purificado que comprende la secuencia de: SEQ ID NO: 7; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. El uso de cualquiera de los genes optimizados de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia en un sujeto.