Factor VIII recombinante modificado.

Una molécula de FVIII recombinante, en donde dicha molécula se conjuga covalentemente con al menos un grupo lateral hidrófobo,

en donde el grupo lateral hidrófobo está ligado a dicha molécula a través de un ácido siálico, en donde dicho grupo lateral hidrófobo está conjugado covalentemente con un O-glicano a través de un ácido siálico, en donde dicho O-glicano está situado en un dominio B truncado y en donde la activación de FVIII da como resultado la eliminación de dicho grupo lateral hidrófobo.

Factor VIII recombinante modificado Campo de la invención La presente invención se refiere a proteínas modificadas. En particular, la presente invención se refiere a proteínas tales como, por ejemplo, factores de coagulación conjugados con un grupo lateral hidrófobo. La invención se refiere además al uso de tales moléculas, así como a métodos para producir tales moléculas.

Antecedentes de la invención La hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario causado por una deficiencia o disfunción de la actividad del factor de coagulación VIII (FVIII) . El cuadro clínico no está en la homeostasis primaria -se produce normalmente la formación del coágulo sanguíneo – sino que el coágulo es inestable debido a la falta de formación de trombina secundaria. La enfermedad se trata mediante inyección intravenosa de factor de coagulación FVIII que, o bien se aísla a partir de la sangre o se produce de forma recombinante. Los pacientes que tienen hemofilia A con inhibidores se pueden tratar mediante administración a demanda del factor VIla (FVIIa) . La hemofilia B está causada por una deficiencia o disfunción de la actividad del factor de coagulación IX (FIX) y los pacientes se pueden tratar mediante administración a demanda del factor IX (FIX) .

Las recomendaciones actuales para un tratamiento están abandonando el tratamiento a demanda tradicional para pasar a la profilaxis. La semivida circulatoria de FVIII endógeno unido al factor de von Willebrandt es de 12-14 horas y, por lo tanto, el tratamiento profiláctico de debe realizar varias veces a la semana con el fin de que los pacientes tengan una vida prácticamente exenta de síntomas. La semivida circulatoria del factor VII endógeno es menor de 2 horas. La semivida circulatoria del factor IX endógeno es de 19-24 horas. La administración i.v. está asociada en muchas personas, especialmente en niños y jóvenes, con molestias y/o dolor significativo. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de prolongar la semivida circulatoria de factores de coagulación recombinantes. Existe igualmente una necesidad en la técnica de prolongar la semivida de una variedad de otras proteínas y péptidos terapéuticos de una manera dirigida al sitio, que dé como resultado preferiblemente un producto relativamente homogéneo y bien definido.

Se han empleado diversos métodos en el desarrollo de factores de coagulación y de proteínas farmacéuticas en general, con una semivida circulatoria significativamente prolongada. Algunos de estos métodos se refieren a la conjugación con polímeros hidrófilos tales como por ejemplo, PEG (polietilenglicol) . La conjugación con cadenas laterales hidrófobas realizada por una parte, constituye un enfoque atractivo debido al hecho de que tales grupos se pueden degradar completamente in vivo. Por otro lado, la conjugación de proteínas con uno o varios restos hidrófobos bien definidos, no ha constituido hasta ahora un enfoque atractivo para la prolongación de la semivida de proteínas relativamente grandes, incluyendo factores de coagulación, tales como por ejemplo, FVIII. De hecho, la conjugación de tales restos hidrófobos con proteínas no se consideraría un enfoque realista debido a: 1) las proteínas grandes tales como FVIII solo son estables en tampones acuosos carentes de disolventes orgánicos; 2) restos lipófilos tales como ácidos grasos son insolubles en tales tampones acuosos; 3) sería dudoso que la fijación de restos lipófilos relativamente pequeños diera como resultado cualquier prolongación significativa de proteínas mucho más grandes, como por ejemplo, FVIII; 4) restos lipófilos, cuando se fijan a la superficie de proteínas que normalmente es hidrófila, pueden alterar su estabilidad debido a la agregación o ser energéticamente favorables pero con un plegamiento perjudicial; y 5) la interacción de la proteína con sus parejas de unión naturales se puede alterar de forma similar, lo que conduce a una actividad biológica reducida.

El documento WO2009/108806 describe una molécula de Factor VIII con el dominio B truncado con una semivida circulatoria modificada, estando dicha molécula conjugada covalentemente con un polímero hidrófilo a través de un oligosacárido ligado a O en el dominio B truncado, en donde la activación del Factor VIII da como resultado una eliminación del grupo lateral conjugado covalentemente.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a una molécula de FVIII recombinante, en donde dicha molécula se conjuga covalentemente con al menos un grupo lateral hidrófobo, en donde el grupo lateral hidrófobo está ligado a dicha molécula a través de un ácido siálico, en donde dicho grupo lateral hidrófobo está conjugado covalentemente con un Oglicano a través de un ácido siálico, en donde dicho O-glicano está situado en un dominio B truncado y en donde la activación de FVIII da como resultado la eliminación de dicho grupo lateral hidrófobo.

Tales conjugados tienen una semivida circulatoria modificada y tienen preferentemente una estructura relativamente homogénea. Los conjugados, además, conservan la actividad biológica y se producen preferiblemente sin utilizar ningún disolvente orgánico. Sin embargo, es posible emplear un método para preparar tales moléculas en donde dicho método comprende el uso de cantidades traza de disolventes orgánicos.

Descripción de la invención

Definiciones:

Moléculas de Factor VIII: El FVIII/Factor VIII es una glicoproteína grande, compleja que es producida principalmente por los hepatocitos. FVIII consiste en 2351 aminoácidos que incluyen un péptido señal y contiene varios dominios distintos, tal y como se definen por homología. Hay tres dominios A, un dominio B único y dos dominios C. El orden de los dominios se puede representar como NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. FVIII circula en el plasma en forma de dos cadenas, separadas en la zona límite B-A3. Las cadenas están conectadas por enlaces iónicos de metales bivalentes. La cadena A1-A2-B se denomina la cadena pesada (CP) , mientras que la A3-C1-C2 se denomina la cadena ligera (CL) .

Las moléculas del Factor VIII endógeno circulan in vivo como una agrupación de moléculas con dominios B de dife

rentes tamaños. Lo que probablemente ocurre in vivo es una eliminación enzimática gradual del dominio B, dando como resultado una agrupación de moléculas con dominios B de diversos tamaños. En general se cree que la escisión en la posición 740, con la que se elimina la última parte del dominio B, se produce en conexión con la activación de la trombina. Sin embargo, no se puede descartar que una variante del Factor VIII en la que por ejemplo, el sitio de escisión en la posición 740 se ha deteriorado, pueda ser activa.

"Factor VIII" o "FVIII" tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a una glicoproteína plasmática humana que es un miembro de la vía de coagulación intrínseca y es esencial para la coagulación de la sangre. "FVIII" es la molécula de FVIII humana de longitud completa, tal y como se muestra en SEQ ID NO. 2 (aminoácidos 1-2332) . El dominio B abarca los aminoácidos 741-1648 en la SEQ ID NO 2.

SEQ ID NO 2:

Las moléculas de factor VIII en esta memoria pueden ser moléculas del Factor FVIII con el dominio B truncado en donde los dominios restantes se corresponden estrechamente con la secuencia tal y como se describe en los aminoácidos nº 1-740 y 1649-2332 en SEQ ID NO. 2, aunque también puede haber una o más alteraciones dentro de la 5 región de unión a vWF, entre los residuos 1670-1684. Un enlazador preferido del dominio B (21 aminoácidos) en esta memoria se expone en SEQ ID NO 4 (SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR) . Las moléculas de FVIII en esta memoria pueden diferir ligeramente de la secuencia expuesta en SEQ ID NO 2, lo que significa que los dominios restantes (es decir, los tres dominios A y los dos dominios C) pueden diferir ligeramente por ejemplo, en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9

se expone en SEQ ID NO 2 (aminoácidos 1-740 y 1649-2332) debido al hecho de que se pueden introducir mutaciones con el fin, por ejemplo, de reducir la capacidad de unión a vWF. Además, es plausible que las modificaciones de aminoácidos (sustituciones, deleciones, etc.) se introduzcan en otros lugares en la molécula con el fin de modificar la capacidad de unión del Factor VIII a varios otros componentes, tales como por ejemplo, LRP, diversos receptores, otros factores de coagulación, superficies celulares, introducción y/o supresión de sitios de glicosilación, etc.

Las moléculas del Factor VIII en esta memoria tienen actividad de Factor VIII, es decir, la capacidad de actuar en la cascada de coagulación de una manera funcionalmente similar o equivalente a FVIII, inducir... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de FVIII recombinante, en donde dicha molécula se conjuga covalentemente con al menos un grupo lateral hidrófobo, en donde el grupo lateral hidrófobo está ligado a dicha molécula a través de un ácido siálico, en donde dicho grupo lateral hidrófobo está conjugado covalentemente con un O-glicano a través de un ácido siáli

co, en donde dicho O-glicano está situado en un dominio B truncado y en donde la activación de FVIII da como resultado la eliminación de dicho grupo lateral hidrófobo.

2. Una molécula de FVIII según la reivindicación 1, en donde los restos de la cadena pesada y ligera del polipéptido precursor de FVIII están separados por un enlazador, en donde la secuencia del enlazador se obtiene a partir del dominio B de FVIII, y en donde el enlazador comprende un sitio de reconocimiento para la proteasa que separa el polipéptido precursor de FVIII con el dominio B truncado en la cadena pesada y ligera.

3. Una molécula de FVIII según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la longitud del dominio B truncado es d.

2. 30 aminoácidos.

4. Una molécula de FVIII según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el grupo lateral hidrófobo se selecciona entre uno o varios del grupo que consiste en: ácido graso y diácido graso.

5. Una molécula de FVIII según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha molécula de FVIII tiene una capacidad de unión a vWF reducida.

6. Una molécula de FVIII según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha molécula de FVIII está conjugada además con al menos un polímero hidrófilo.

7. Un método de preparación de una molécula según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en

donde dicho método comprende la fijación de un grupo lateral hidrófobo a una proteína recombinante a través de una reacción catalizada por una sialiltransferasa.

8. Uso de una molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para el tratamiento de la hemofilia.

9. Una composición farmacéutica que comprende una molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.