Extractos purificados de algas verde azuladas y método de uso.

Una composición que comprende una forma seca de extracto acuoso o de solución salina amortiguada de Aphanizomenon flos aquae,

en donde el extracto se enriquece con un Ligando de L-selectina; y

Una forma seca de extracto etanólico de Aphanizomenon flos aquae.

Extractos purificados de algas verde azuladas y método de uso Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. No. 6/693, 88, presentada en junio 24, 25, y la Solicitud Provisional U.S. No. 6/7,882, presentada en julio 19, 25.

Campo

Esta solicitud se relaciona con una forma seca de un extracto acuoso de algas verde azuladas, tal como un extracto acuoso de algas que incluyen un ligando de selectina.

Antecedentes

Las células madre son células pluripotentes derivadas de tejido somático capaz de diferenciarse en células más especializadas. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas se pueden diferenciar en muchos diferentes tipos de células sanguíneas, incluyendo las células sanguíneas rojas, las plaquetas, y los leucocitos.

Las células madre hematopoyéticas juegan un papel en el continuo reaprovisionamiento fisiológico durante toda la vida de las células sanguíneas. Las células madre se convierten en células específicas de tejido tanto células de linaje hematopoyético como no hematopoyético. Recientemente, se ha encontrado que las células madre se diferencian en una variedad de tipos de célula específicas de tejido tales como miocitos, hepatocitos, osteocitos, células gliales, y neuronas. Por ejemplo, se ha mostrado que las células madre cruzan la barrera hematoencefálica (Williams and Hichey, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 22: 221-245, 1995)y se diferencian en neuronas(Mezey, Science 29: 1779- 82, 2). Así, es posible que las células madre se pudieran utilizar para tratar la enfermedad de Parkinson (Polli, Haematologica 85: 19-1,2), la enfermedad de Alzheimer (Mattson, Exp. Gerontol. 35: 489- 52, 2), y daño cerebral traumático (Magavi, Nature 45: 892-3, 895, 2). Las células madre también han mostrado diferenciarse en fibroblastos o células similares a fibroblastos, y a colágeno expreso (Periera et al., Proc, Nati. Acad. Sci. 95: 1142-7, 1998), así, es posible que las células madre se puedan utilizar para tratar osteogénesis imperfecta y fracturas de hueso. Peterson et al., (Science 284: 1168-7, 1999) también han mostrado que las células del hígado pueden surgir de células madre. Así, las células madre se pueden utilizar para tratar una variedad de patologías del hígado, incluyendo, pero no estando limitado a cirrosis. La médula ósea derivada de las células madre ha demostrado migrar al sitio del infarto del miocardio y formar miocardio (Orlic, Nature 41: 71-5, 2). Así, se puede utilizar las células madre para tratar infarto del miocardio.

En razón a que las células madre son capaces de diferenciarse en una amplia variedad de tipos de célula, ellas juegan un papel importante en la curación y los procesos regenerativos de varios tejidos y órganos (ver Koc et al., Bone Marrow Transplant, 27 (3): 235-39, 21). Los ligandos de selectina estimulan la liberación de las células madre provenientes de la médula ósea (Frenette et al., Blood 96: 246-68. 2).

Muchos estudios sugieren que la movilización, migración y diferenciación de las células madre de la medula ósea en tejido objetivo constituyen un fenómeno natural de curación en el cuerpo humano (Spenceret al., Thorax 6(1): 6-2, 25; Ishikawa et al., FASEB J. 18(15): 1958-6, 24; Mattsson et al., Transplantation 15; 78(1): 154-7, 24; Thiele Jet al., Transplantatio 77(12): 192-5, 24; Cogle et al., The Lancet 363(9419): 1432-7, 24; Deb et al., Circulation 17(9): 1247-9, 23. Korbling et al., N Engl J Med 346(1): 738-46, 22; Adams et al., Blood 12(1): 3845-7, 22 ; Krause et al., Cell 15(3): 369-77 21). Las células madres movilizadas siguen los gradientes de concentración de las citocinas liberadas por tejidos dañados y migran por sí mismas a tejidos que siguen tales gradientes. De hecho, la movilización de las células madres de la médula ósea inducidas por inyección de citocinas ha mostrado que aceleran la curación del tejido cardiaco después de un infarto agudo de miocardio. Por lo tanto, disparar simplemente la movilización de las células madre de la médula ósea con un consumible efectivo y seguro puede mejorar este proceso fisiológico natural y suministrar una terapia potencial para varias patologías. Así, subsiste la necesidad de composiciones que incrementen la movilización y el tráfico de células madre.

Los extractos basados en agua de Aphanizomenon flos aquae y su uso para tratar tumores se describe en Ind. I. of Microbio-logy, vol. 43(1), 23, pages 9-16 (K. Kunar et al).

En el primer aspecto de la presente invención se suministra una composición que comprende una forma seca de un extracto salino acuoso o amortiguado de Aphanizomenon flos aquae, en donde el extracto es enriquecido por un ligando de L-selectina; y

Una forma seca de un extracto etanólico de Aphanizomenon flos aquae.

Aquí Se describe un extracto de Aphanizomenon flos aquae (AFA) que contiene el ligando de L-selectina. Este extracto se puede formular para administración a un sujeto. Las composiciones que incluyen el extracto se pueden administrar a un sujeto necesitado de movilización de células madre y/o un número creciente de células madre circulantes. En un ejemplo, el extracto que contiene el ligando de L-selectina se administra con un extracto de Aphanizomenon flos aquae (AFA) que contiene polisacáridos. Las composiciones, que incluyen el ligando de L- selectina de Aphanizomenon flos aquae (AFA) se utilizan para la movilización de células madre e incrementar el número de células madre circulantes.

Aquí se describe un método para disparar la movilización de células madre al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un extracto específico de Aphanizomenon flos aquae a un sujeto. Los extractos se administran en conjunto con otros extractos de Aphanizomenon flos aquae (AFA) que contienen polisacáridos.

La administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un extracto de algas verde azuladas, tal como un extracto que contiene un ligando de selectina, induce un incremento transitorio en la población de algunas células madre, tal como las células madre CD34+ y/o las células madre CD133+, en el sistema circulatorio del sujeto.

Lo anterior y otras características y ventajas se volverán más evidentes de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones, que prosigue con referencia a las figuras que la acompañan.

Breve descripción de las figuras.

La Fig. 1 es una gráfica lineal que muestra el curso del tiempo para el Incremento en el número de células madre circulantes en la sangre de humanos saludables luego de la ingestión de AFA. Se efectúa una citometría de flujo en los linfocitos y monocitos humanos, donde se utilizó anticuerpo monoclonal CD34, con especificidad para células madres humanas para demostrar que el extracto A de AFA contiene un compuesto que moviliza las células madre al incrementar su número en la circulación sanguínea.

La Fig. 2 es una gráfica de barras que muestra la citometría de flujo que se efectuó en linfocitos, monoclitos y células nucleadas polimórficas humanas, donde el anticuerpo monoclonal TQ1 , específico para el área de unión de ligando de la selectina L humana se utilizó para demostrar que un extracto AFA contiene un compuesto que compite por la unión del sitio de unión del ligando de L-selectina. El efecto de competencia entre el anticuerpo TQ1 y el compuesto proveniente del extracto de AFA es dependiente de la concentración.

La Fig. 3 es una Ilustración esquemática del método utilizado para purificar el ligando de selectina proveniente del Extracto A de AFA. Se recubrieron gránulos magnéticos con proteína G, que se une a la porción FC de la inmunoglobulina. Estas gránulos se utilizaron para capturar una proteína recombinante quimérica que consiste de la porción extracelular de la L-selectina humana, unida con una porción Fe de la inmunoglobulina humana lgG1.Se efectuó una reacción química para formar uniones covalentes entre la porción Fe de la quimera y la proteína G sobre las gránulos magnéticos. Estos gránulos, ahora recubiertos con la quimera, con la porción extracelular de la L- selectlna que llegan desde las gránulos, se utilizaron para capturar el ligando para la L-selectina en extractos AFA.

Las Figs. 4A-4B son imágenes digitales que muestran la electroforesis de gel que ilustra el peso molecular aproximado del compuesto que fue purificado por afinidad proveniente del extracto A de AFA, cuando se empleó el método de afinidad descrito en la Fig. 3. Las figuras son imágenes digitales de geles, en donde se efectuó electroforesis de gel sobre material eluido de gránulos magnéticos después de que estos gránulos habían capturado el ligando de selectina del extracto... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una forma seca de extracto acuoso o de solución salina amortiguada de Aphanizomenon flos aquae, en donde el extracto se enriquece con un Ligando de L-selectina; y

Una forma seca de extracto etanólico de Aphanizomenon flos aquae.

2. La composición de la reivindicación 1 que comprende, además, un portador farmacéuticamente aceptable

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde el extracto de etanol se produce al suspender Aphanizomenon flos aquae seco en 1 a 2 por ciento de etanol en aproximadamente 5°C a aproximadamente

6°C.

4. La composición de la reivindicación 3 que comprende 1 gramo a aproximadamente 2 gramos, preferiblemente 1 gramo, de un extracto seco de solución acuosa o solución salina de Aphanizomenon flos aquae, en donde el extracto es enriquecido por un ligando de L- selectina, y 1 mg a 5 mg, de un extracto de etanol seco de Aphanizomenon flos aquae.

5. La composición de la reivindicación 3, obtenible mediante el proceso de

poner en contacto una primera cantidad de Aphanizomenon flos aquae en.1 molar de solución salina amortiguada con fosfato o agua durante aproximadamente media hora a aproximadamente 12 horas para producir un extracto

acuoso:

Retirar el material solido del extracto acuso;

Secar el extracto acuoso para producir una composición sólida que comprende un ligando de L-selectina;

Incubar una segunda cantidad de Aphanizomenon flos aquae en 1% de etanol a aproximadamente 5°C durante aproximadamente una hora para producir un extracto de etanol;

retirar el material solido del extracto de etanol; secar el material solido proveniente del extracto de etanol para producir una forma sólida del extracto de etanol; y

mezclar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición sólida que comprende el ligando de L-selectina y una cantidad terapéuticamente efectiva de la forma sólida del extracto de etanol.

6. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en un método para movilizar las células madre hematopoyéticas en un sujeto, que pretende administrar al sujeto, una cantidad terapéuticamente efectiva del producto, movilizando de esta manera las células madre hematopoyéticas en el sujeto.

7. El producto de la reivindicación 6, en donde las células madre hematopoyéticas expresan CD34 (CD34+), CD133

(CD133+), o ambas.

8. El producto de la reivindicación 6 o 7 en donde el sujeto es un humano.

9. El producto de la reivindicación 6 o 7 en donde el sujeto es un sujeto veterinario.

1. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el método comprende, además, medir el número de células madre CD34+ en el sujeto.

11. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1, en donde el sujeto es saludable.

12. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1, en donde el sujeto es ¡nmunosuprimido y tiene enfermedad crónica, y enfermedad traumática, o enfermedad degenerativa.

13. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1, en donde el sujeto tiene un trastorno del sistema digestivo, sistema nervioso, sistema linfático, sistema cardiovascular o sistema endocrino.

14. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1, en donde el sujeto tiene osteoporosis, enfermedad de Alzhelmer, Infarto cardiaco, enfermedad de Parklnson, daño traumático del cerebro, esclerosis múltiple o cirrosis del hígado.

15. El producto de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, donde las células madre que se anidan se incrementa aproximadamente 1% a aproximadamente 5% comparadas con el control.