Evento de maíz TC1507 y métodos para la detección del mismo.

Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID Nº 21, 22, 24, 26 o 27.

Evento de maíz TC157 y métodos para la detección del mismo Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas, específicamente la invención se refiere a una construcción de ADN para conferir resistencia a insectos a una planta. La invención se refiere más específicamente a una planta de maíz resistente a insectos TC157 y a ensayos para detectar la presencia del ADN de la planta de maíz TC157 en una muestra y composiciones de la misma.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a la planta de maíz resistente a insectos (Zea mays) TC157, también mencionada como línea de maíz TC157 o evento de maíz TC157, y a la construcción de expresión en plantas de ADN de la planta de maíz TC157 y a la detección del transgén/región de inserción flanqueante en la planta de maíz TC157 y la descendencia de la misma.

El maíz es un cultivo importante y es una fuente primaria de alimento en muchas áreas del mundo. Los daños causados por plagas de insectos es un factor principal en la pérdida de los cultivos de maíz en el mundo, a pesar del uso de medidas protectoras tales como pesticidas químicos. En vista de esto, se ha diseñado por ingeniería genética la resistencia a insectos en cultivos tales como maíz para controlar los daños por insectos y para reducir la necesidad de pesticidas químicos tradicionales. Un grupo de genes que se ha utilizado para la producción de cultivos transgénicos resistentes a insectos son las delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). Las delta- endotoxinas se han expresado satisfactoriamente en plantas de cultivo tales como algodón, patatas, arroz, girasol, así como maíz, y han demostrado proporcionar excelente control sobre plagas de insecto. (Perlak, F.J et al. (199) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) PlantMol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2) Nature Biotechnology 18:111-114; publicación PCT número WO 1/13731; y Bing JW et al. (2) Efficacy of CrylF Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO).

Se sabe que la expresión de genes foráneos en plantas está influenciada por su localización en el genoma vegetal, quizá debido a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de elementos reguladores de la transcripción (por ejemplo, potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Al mismo tiempo la presencia del transgén en diferentes localizaciones en el genoma influirá en el fenotipo global de la planta de diferentes modos. Por esta razón, a menudo es necesario explorar una gran cantidad de eventos para identificar un evento caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre eventos. También puede haber diferencias en los patrones espaciales o temporales de expresión, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales, que pueden no corresponder a los patrones esperados de los elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción génica introducida. Por esta razón, es habitual producir de cientos a miles de diferentes eventos y explorar esos eventos para un único evento que tenga los niveles y patrones deseados de expresión del transgén con fines comerciales. Un evento que tenga niveles o patrones deseados de expresión del transgén es útil para la introgresión del transgén en otros fondos genéticos por cruce exogámico sexual usando métodos convencionales de reproducción. La descendencia de estos cruces mantiene las características de expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar una expresión génica fiable en varias variedades que están bien adaptadas a condiciones locales de cultivo.

Sería ventajoso ser capaces de detectar la presencia de un evento particular para determinar si la descendencia de un cruce sexual contiene un transgén de interés. Además, sería provechoso un método para detectar un evento particular para cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación pre-comercialización y etiquetado de alimentos derivados de plantas recombinantes de cultivo, por ejemplo, o para su uso en control medioambiental, control de rasgos en cultivos en el campo, o control de productos derivados de una recolección de cultivo, así como para su uso en asegurar la conformidad de las partes sujetas a términos normativos o contractuales.

Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier método de detección de ácido nucleico conocido en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Estos métodos de detección generalmente se centran en los elementos genéticos frecuentemente usados, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., porque para muchas construcciones de ADN, la región codificante es intercambiable. Como resultado, dichos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, particularmente aquellos producidos usando la misma construcción de ADN o construcciones muy similares salvo que se conozca la secuencia de ADN del ADN flanqueante adyacente al ADN heterólogo insertado. Por ejemplo, se describe un ensayo de PCR específico de evento en la patente de Estados Unidos N° 6.395.485 para la detección del evento selecto GAT-ZM1. Por consiguiente, sería deseable tener un método simple y discriminativo para la identificación del evento TC157.

Sumario de la invención

Esta descripción se refiere preferiblemente a métodos para producir y seleccionar una planta de cultivo monocotiledónea resistente a insectos. Más específicamente, se proporciona una construcción de ADN que cuando se expresa en células vegetales y plantas confiere resistencia a insectos.

Por consiguiente, se proporciona una construcción de ADN, con capacidad de introducción y replicación en una célula hospedadora, que cuando se expresa en células vegetales y plantas confiere resistencia a insectos a las células vegetales y plantas. La construcción de ADN está compuesta por una molécula de ADN llamada PHI8999A e incluye dos casetes de expresión transgénica. El primer casete de expresión comprende una molécula de ADN que incluye el promotor, el exón no traducido 5', y el primer intrón del gen de la ubiquitina de maíz (Ubi-1) (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 y Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) conectado de forma funcional a una molécula de ADN que codifica una 5-endotoxina de B.t. identificada como CrylF (patentes de Estados Unidos N° 5.188.96 y 6.218.188) conectada de forma funcional a una molécula de ADN que comprende un terminador de la transcripción 3' ORF25 aislado de Agmbacterium tumefaciens (Barker et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2:335-35). El segundo casete de expresión transgénica de la construcción de ADN comprende una molécula de ADN del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell J.T. et al. (1985) Nature 313: 81-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) conectado de forma funcional a una molécula de ADN que codifica un gen de fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 7: 25-37) conectado de forma funcional a una molécula de ADN que comprende un terminador de la transcripción 3' de 35S (CaMV) (véase Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59). También se proporcionan plantas que contienen la construcción de ADN.

Se proporcionan composiciones y métodos para identificar una nueva planta de maíz denominada TC157, estando basados los métodos en cebadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' y/o 3' de TC157. Se proporcionan moléculas de ADN que comprenden secuencias cebadoras que cuando se utilizan en una reacción de PCR producirán amplicones únicos para el evento transgénico TC157. Estas moléculas pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en:

5'-GT AGT ACT AT AGATT AT ATT ATT CGT AGAG-3' (SEC ID N° 1);

5'-GCCATACAGAACTCAAAATCTTTTCCGGAG-3' (SEC ID N° 2);

5'-CTTCAAACAAGTGTGACAAA-3' (SEC ID N° 23);

5'-TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA-3' (SEC ID N° 3);

5'-AGCACCTTTTCATTCTTTCATATAC-3' (SEC ID N° 4);

5'-GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC-3' (SEC ID N° 5);

y complementos de las mismas. La planta y semilla de maíz que comprende estas moléculas es un aspecto de esta invención. Además, se proporcionan kits que utilizan... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID N° 21, 22, 24, 26 o 27.

2. Un kit para identificar el evento TC157 en una muestra biológica que detecta una región específica de TC157, comprendiendo dicho kit un primer cebador que reconoce la SEC ID N° 21 o SEC ID N° 22, y un segundo cebador que reconoce la SEC ID N° 25.

3. El kit de la reivindicación 2, en el que dichos al menos primero y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEC ID N° 1 y SEC ID N° 2, respectivamente.

4. El kit de la reivindicación 2, en el que dichos al menos primero y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEC ID N° 2 y SEC ID N° 23, respectivamente.

5. El kit de la reivindicación 2, en el que dichos al menos primero y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEC ID N° 3 y SEC ID N° 5, respectivamente.

6. El kit de la reivindicación 2, en el que dichos al menos primero y segundo cebadores comprenden la secuencia de la SEC ID N° 4 y SEC ID N° 5, respectivamente.

7. Un kit de detección de ADN que comprende al menos una molécula de ADN que es homologa o complementaria a la SEC ID N° 26 o 27, en el que la molécula de ADN es específica para el ADN de unión del evento de maíz TC157 y es de una longitud suficiente de polinucleótidos de ADN contiguos para funcionar en un método de detección de ADN.

8. Un kit para identificar el evento TC157 en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit: una sonda específica que comprende una secuencia que híbrida con la SEC ID N° 21 y la SEC ID N° 25, contigua con la misma.

9. Un kit para identificar el evento TC157 en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit: una sonda específica que comprende una secuencia que híbrida con la SEC ID N° 22 y la SEC ID N° 25, contigua con la misma.

1. Un kit de detección de ADN que comprende una sonda polinucleotídica que híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con una o más secuencias de ADN seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 y complementos de las mismas.

11. Un kit de detección de ADN que comprende un par de cebadores que comprende cada uno al menos 1 nucleótidos de la SEC ID N° 26 y SEC ID N° 27, en el que cada uno está en lados opuestos de una secuencia diagnóstica para la inserción del evento TC157.

12. Un método para identificar el evento TC157 en una muestra biológica, que comprende detectar una región específica de TC157 con una sonda o primer cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro de la SEC ID N° 21 o SEC ID N°22.

13. El método de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente amplificar un fragmento de ADN de un ácido nucleico presente en dicha muestra biológica usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, en el que dicho primer cebador reconoce una secuencia dentro de la SEC ID N° 21 o SEC ID N° 22, y un segundo cebador reconoce una secuencia dentro de la SEC ID N° 25.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicho primer cebador reconoce una secuencia dentro de la SEC ID N° 21 y dicho segundo cebador reconoce una secuencia dentro de la SEC ID N° 25.

15. El método de la reivindicación 12, en el que dicho primer cebador reconoce una secuencia dentro de la SEC ID N° 22 y un segundo cebador reconoce una secuencia dentro de la SEC ID N° 25.

16. El método de la reivindicación 14, en el que dichos primero y segundo cebadores comprenden: la secuencia de la SEC ID N° 2 y SEC ID N° 1 respectivamente; o la secuencia de la SEC ID N° 2 y SEC ID N° 23 respectivamente.

17. El método de la reivindicación 15, en el que dichos primero y segundo cebadores comprenden: la secuencia de la SEC ID N° 3 y SEC ID N° 5 respectivamente; o la secuencia de la SEC ID N° 4 y SEC ID N° 5 respectivamente.

18. El método de la reivindicación 16, que comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 912 pb, aproximadamente 844 pb, aproximadamente 342 pb, o aproximadamente 252 pb usando un protocolo de identificación por PCR de TC157.

19. Un método para detectar la presencia del evento de maíz TC157 o descendencia del mismo en una muestra

biológica, que comprende:

(a) extraer una muestra de ADN de dicha muestra biológica;

(b) proporcionar las moléculas cebadoras de ADN SEC ID N° 1 y SEC ID N° 2, SEC ID N° 2 y SEC ID N° 23, SEC ID N° 3 y SEC ID N° 5, o SEC ID N° 4 y SEC ID N° 5;

(c) proporcionar condiciones de reacción de amplificación de ADN;

(d) realizar dicha reacción de amplificación de ADN, produciendo de ese modo una molécula de amplicón de ADN; y

(e) detectar dicha molécula de amplicón de ADN, donde la detección de dicha molécula de amplicón de ADN en dicha reacción de amplificación de ADN indica la presencia del evento de maíz TC157.

2. Una molécula de ADN aislada que comprende el amplicón producido por el método de la reivindicación 19.

21. Un método para detectar la presencia de ADN correspondiente al evento TC157 en una muestra, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra que comprende ADN de maíz con una sonda polinucleotídica que híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con ADN del evento de maíz TC157 y no híbrida en dichas condiciones rigurosas de hibridación con un ADN de planta de maíz no TC157;

(b) someter la muestra y la sonda a condiciones rigurosas de hibridación; y

(c) detectar la hibridación de la sonda al ADN, donde la detección de hibridación indica la presencia del evento TC157.

22. Una secuencia cebadora nucleotídica de ADN aislada que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 o su complemento.

23. Un par de moléculas de ADN que comprende: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en el que las moléculas de ADN son de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEC ID N° 26 o su complemento, o de la SEC ID N° 27 o su complemento, para funcionar como cebadores o sondas de ADN diagnósticos para el ADN extraído de una planta de maíz TC157 o descendencia de la misma.

24. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de unión que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 y complementos de las mismas.

25. Un método para confirmar la pureza de las semillas, que comprende la detección de una región específica de TC157 con un cebador o sonda específico que reconoce específicamente una secuencia dentro de la SEC ID N° 21 o SEC ID N° 22, en una muestra de semillas.

26. Un método para explorar semillas para la presencia del evento TC157, que comprende la detección de una región específica de TC157 con un cebador o sonda específico que reconoce específicamente una secuencia dentro de la SEC ID N° 21 o SEC ID N° 22 en una muestra de un lote de semillas.

27. Una secuencia de ADN aislada que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en ADN que tiene al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 y complementos de las mismas.

28. Un par de secuencias de ADN aisladas, que comprenden cada una al menos diez nucleótidos y que cuando se usan juntas en un procedimiento de amplificación de ADN producirá un amplicón diagnóstico para el evento TC157.

29. El par de secuencias de ADN aisladas de la reivindicación 28 en el que cada una se elige entre la SEC ID N° 26; o en el que cada una se elige entre la SEC ID N° 27.

3. Un método para detectar la presencia de la inserción del evento TC157 en tejido de maíz que comprende:

(a) seleccionar un par de cebadores que comprenden cada uno al menos diez nucleótidos de la SEC ID N° 26 o SEC ID N° 27 en el que cada miembro del par está en lados opuestos de una secuencia diagnóstica para dicha inserción del evento TC157;

(b) poner en contacto una muestra de dicho tejido de maíz con dicho par de cebadores;

(c) realizar amplificación de ADN y analizar para la presencia de amplicones.

31. El método de la reivindicación 3 en el que cada miembro del par de cebadores se selecciona entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 23, 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 y complementos de las mismas.

32. Un método para detectar la presencia de la inserción del evento TC157 en tejido de maíz que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de dicho tejido de maíz con una sonda polinucleotídica que híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con una o más secuencias de ADN seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 y complementos de las mismas;

(b) someter dicha muestra y sonda a condiciones rigurosas de hibridación; y

(c) analizar para la hibridación de la sonda.

33. El kit de detección de ADN de la reivindicación 11 en el que cada miembro del par de cebadores se selecciona entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 23, 45, 46, 47, 49, 5, 51, 52, 54, 55, 56 y 57 y complementos de las mismas.

34. Un método para identificar TC157 en una muestra biológica que detecta una región específica de TC157 dentro de la SEC ID N° 24.