ETS2 y Mesp1 generadores de progenitores cardíacos a partir de fibroblastos.

Un procedimiento de preparación de una célula progenitora cardiaca inducida,

comprendiendo el procedimiento la suministro de un factor de reprogramación que comprende dos genes heterólogos a una célula somática,

caracterizado porque los genes heterólogos son ETS2 y Mesp1.

ETS2 y Mesp1 generadores de progenitores cardíacos a partir de fibroblastos Campo de la invención La presente solicitud reivindica prioridad respecto de la Solicitud de Patente Provisional US número de serie 61/339.509, presentada el 5 de marzo de 2010, titulada ETS2 AND MESP1 GENERATE CARDIAC PROGENITORS FROM FIBROBLASTS, de la que todo el contenido se incorpora en la presente memoria por referencia.

Un aspecto de la presente invención se refiere, en general, al campo de la diferenciación celular y, más específicamente, a una estrategia para la regeneración de tejido cardiovascular a través del aislamiento, renovación y diferenciación dirigida, de fibroblastos en tipos de células cardíacas maduras específicas, de marcapasos, musculares lisas y endoteliales.

Antecedentes El daño a los tejidos del corazón de mamíferos frecuentemente resulta en la pérdida de un gran número de células cardiacas, incluyendo células maduras cardiacas, células del marcapasos, musculares lisas y células endoteliales. Aunque hay alguna indicación de que las células cardíacas se pueden regenerar en los seres humanos (Bergmann et al., 2009) , el mecanismo no se entiende bien y el proceso no parece proceder con la suficiente rapidez para reparar tipos comunes de daño cardíaco, tal como isquemia, infarto , traumatismo o lesión debido a toxinas o infecciones virales. Por lo tanto, un objetivo central de la medicina cardiaca experimental ha sido el desarrollo de un medio para la regeneración de células cardiacas que se han perdido debido al daño cardíaco. Se han realizado estudios de los mecanismos detrás de la cardiogénesis embrionaria, con el objetivo de replicar la cardiogénesis in vitro o in vivo para los fines de la regeneración de tejido dañado.

Investigaciones recientes han identificado células progenitoras cardiovasculares multipotentes (MICP) (ISL1 +) , que son capaces de diferenciarse para formar el tejido cardíaco maduro. Las células MICP derivadas de células madre embrionarias (ES) , que pueden dar lugar a células endoteliales, cardiacas, y musculares lisas, se han aislado (Moretti et al., 2006) . Los estudios genéticos han demostrado que estas células MICP expresan Isl1, Nkx2.5 y Flkl.

Los sistemas modelo para la investigación de cardiogénesis incluyen la ascidia Ciona intestinalis (Beh et al., 2007) . Los estudios de linaje han demostrado que el corazón Ciona adulto se deriva de dos células fundadoras que expresan Ci-Mesp, un factor de transcripción hélice-bucle-hélice básico (bHLH) , y también Ci-Etsl/2 (Imai et al., 2004; Satou et al., 2004) . Además, se expresan ortólogos de ascidia de genes de especificación de corazón conservado NK4 (tinman Nkx2.5) , GATAa (pannier / GATA4 / 5/6) , Hand and Hand-like (Imai et al., 2003; Davidson, 2007; Davidson and Levine, 2003; Satou et al., 2004) . Los embriones konckdown-Ci-Mesp no desarrollaron primordios de corazón, y la inhibición diana de la actividad de Ets1/ 2 también bloqueó la especificación cardíaca y la expansión del campo del corazón. Del mismo modo, los homólogos murinos de Ci-Mesp, Mesp1 y Mesp2 se expresan en el mesodermo temprano destinado a convertirse en mesodermo cráneo-cardíaco (Saga et al., 2000) . Sólo el ratón doble-knockout Mesp1/Mesp2 carecía de cualquier mesodermo cardíaco (Saga et al, 1999;.. Kitajima et al, 2000) , lo que indica un papel para estos genes en la dirección de la aparición de progenitores cardíacos en vertebrados superiores. Las repeticiones de los genes Mesp han hecho que otros estudios en embriones sean una tarea de enormes proporciones.

Lo que se necesita en la técnica es un procedimiento para inducir la cardiogénesis con el fin de regenerar las células cardiacas para el uso en el tratamiento de tejido cardiaco dañado. La reprogramación de células somáticas humanas en células pluripotentes por un número limitado de factores de transcripción importantes para el mantenimiento de la autorrenovación y pluripotencia ha sido reportada por los grupos de Yamanaka, Thomson and Daley (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Park et al., 2008) . Un aspecto de la presente invención proporciona un medio para la reprogramación de las células somáticas y diferenciación dirigida en células progenitoras cardíacas. Por lo tanto, una realización de la presente solicitud proporciona una forma de probar un paradigma regulador único que ETS2 y Mesp1 son transformadoras y, a diferencia de NKX2.5 e ISL1, convierten los fibroblastos no embrionarios normales humanos dérmicos (NHDF) en progenitores cardíacos primarios. Otro aspecto de la presente solicitud fue dilucidar el papel de Mesp1 en la jerarquía reguladora que dirige la aparición de progenitores cardíacos.

Sumario La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una célula progenitora cardiaca de acuerdo con la reivindicación 1.

También se describe la modulación de las capacidades de diferenciación celular utilizando la expresión génica heteróloga. Algunas realizaciones de la invención se refieren a un procedimiento para inducir una célula progenitora cardíaca mediante la entrega de un factor de reprogramación a la célula, en el que el factor de reprogramación comprende ETS2 o una combinación de ETS2 y Mesp1.

El procedimiento proporciona una célula progenitora cardiaca que ha sido inducida mediante la reprogramación de una célula somática, en el que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende el gen ETS2 a la célula somática, la célula somática es un fibroblasto dérmico humano normal (NHDF) , y el factor de reprogramación puede ser ETS2 o Mesp1, o una combinación de los mismos.

También se describe un procedimiento de reprogramación de una célula somática para producir una célula progenitora cardiaca, en el que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende el gen ETS2 a la célula somática. La célula somática puede ser una NHDF, y el factor de reprogramación puede ser ETS2 o Mesp1, o una combinación de los mismos.

Breve descripción de los dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

La FIGURA 1 muestra un mapa esquemático de lentivirus con la inserción de secuencias de codificación de ADN de longitud completa de ETS2 y ELK4. Elementos funcionales y abreviaturas: promotor alfa Ef-1 constitutivo, múltiples sitios de clonación (MCS) , sitio de entrada al ribosoma independiente (IRES) del virus de la poliomielitis humana, secuencia de codificación para una mejora en la proteína verde fluorescente (EGFP) , elemento regulador posterior a la transcripción del virus de hepatitis de la marmota (WPRE) , dominio de activación (AD) , dominio ETS de unión al ADN. Estos plásmidos se generaron mediante técnicas de clonación de ADN recombinante estándar y luego se utilizaron para hacer los lentivirus para infectar fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) ;

La FIGURA 2 muestra (panel superior) NHDF tratados con lentivirus vacíos (pWPI-GFP) , lentivirus pWPI-ELK4-GFP,

o lentivirus pWPI-ETS2-GFP, y (panel inferior) niveles de expresión de GAPDH, NANOG, OCT3/4, Sox2 en células infectadas con virus vacío, virus portador de ETS2, virus portador de ELK4, o paso NHDF no infectado 3 (NHDF-P3) ;

La FIGURA 3 muestra la tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo a un marcador de células madre NANOG en células NHDF-P3 infectadas con lentivirus que porta ETS2, pero no ELK4 o vector vacío (panel superior) . Una transferencia de proteína usando anticuerpo anti-ETS2 reveló la expresión de ETS2 en NHDF infectados con lentivirus que porta ETS2 durante 4 semanas, mientras que NHDF infectados con lentivirus vacío no mostraron ninguna expresión (panel inferior izquierdo) . La tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-ETS2 confirmó la expresión inducida en las células infectadas con lentivirus ETS2 (panel inferior derecho) ;

La FIGURE 4 muestra la inducción de marcadores de células madre NANOG, OCT3/4, SOX2, REX1 y c-MYC en colonias similares a células madre después de 4 semanas de cultivo. Los colores fluorescentes (colores no representados en las figuras) son los siguientes: DAPI (azul) , GFP (verde) , NANOG y OCT3/4 (rojo) , una mezcla de los tres colores se observa en los paneles de "fusión". Las imágenes de colores fluorescentes están disponibles bajo petición;

La FIGURA 5 muestra la citometría de flujo que demuestra... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de una célula progenitora cardiaca inducida, comprendiendo el procedimiento la suministro de un factor de reprogramación que comprende dos genes heterólogos a una célula somática,

caracterizado porque los genes heterólogos son ETS2 y Mesp1.

2. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la célula somática es una célula normal de fibroblastos dérmicos humanos.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el gen ETS2 comprende la secuencia de codificación de ETS2 (SEC ID NO: 9) , el gen ETS2 (SEC ID NO: 7) o codifica la secuencia de proteínas ETS2 humanas (SEC ID NO: 8)

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gen Mesp1 comprende la secuencia de codificación Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 6) , el gen Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 4) o codifica la secuencia de proteínas Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 5)

5. El procedimiento según lo reivindicado en cualquier reivindicación precedente en el que el factor de programación es suministrado a la célula utilizando un vector recombinante.

6. Un procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 5, en el que el factor de programación es suministrado a la célula utilizando el sistema de transducción lentiviral.