Estructuras cristalinas de fragmentos de neuropilina y complejos neuropilina-anticuerpo.

Un cristal de un complejo formado entre un fragmento Nrp2a1a2b1b2 y un fragmento Fab de anticuerpo anti-panNrpA que inhibe la unión de semaforina a Nrp2,

en donde dicho cristal difracta radiación de rayos X para producir un patrón de difracción que representa la estructura tridimensional de dicho complejo, que tiene aproximadamente las siguientes constantes de celda:

a≥148 Å, b≥106 Å, c≥92,4 Å, y un grupo espacial de C2; o

a≥121 Å, b≥121 Å, c≥203 Å, y un grupo espacial de P3221.

Estructuras cristalinas de fragmentos de neuropilina y complejos neuropilina-anticuerpo Campo de la invención

La presente invención proporciona cristales de fragmentos de neuropilina 2 (Nrp2) en complejo con anticuerpos anti- neuropilina. La invención proporciona adicionalmente anticuerpos que se unen a Nrp1 y/o Nrp2 y métodos para su uso.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de un sistema vascular es un requisito fundamental para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Los tejidos de crecimiento activo tales como embriones y tumores requieren un adecuado suministro de sangre. Satisfacen esta necesidad produciendo factores pro-angiogénicos, que promueven la formación de nuevos vasos sanguíneos y el mantenimiento mediante un proceso generalmente mencionado como angiogénesis. La formación vascular es un evento biológico complejo pero metódico que implica todas o muchas de las siguientes etapas: a) proliferan células endoteliales (EC) a partir de EC existentes o se diferencian desde células progenitoras; b) las EC migran y confluyen para formar estructuras tipo cordón; c) los cordones vasculares después experimentan tubulogénesis para formar vasos con un lumen central; d) los cordones o vasos existentes emiten brotes para formar vasos secundarios; e) el plexo vascular primitivo experimenta remodelado y reconformado adicional; y f) se reclutan células peri-endoteliales para revestir los tubos endoteliales, proporcionando mantenimiento y funciones moduladoras a los vasos; incluyendo dichas células pericitos para capilares pequeños, células de músculo liso para vasos más grandes, y células miocárdicas en el corazón. Hanahan, D. Science 277:48-5 (1997); Hogan, B. L. y Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (22); Lubarsky, B. y Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (23).

Ahora está bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una diversidad de trastornos. Estos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades neovasculares infraoculares tales como retinopatías proliferativas, por ejemplo, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), glaucoma neovascular, rechazo inmune de tejido trasplantado de córnea y otros tejidos, artritis reumatoide, y psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:1931- 1934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); y Garner A., "Vascular diseases", En: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2- Edición (Marcel Dekker, NY, 1994), pág. 1625-171.

En el caso de crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar nutrición para el crecimiento y metástasis del tumor. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). La neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. Un tumor habitualmente comienza como una única célula aberrante que puede proliferar solamente hasta un tamaño de unos pocos milímetros cúbicos debido a la distancia desde los lechos capilares disponibles, y puede permanecer "latente" sin crecimiento adicional y diseminación durante un largo periodo de tiempo. Algunas células tumorales después cambian al fenotipo angiogénico para activar las células endoteliales, que proliferan y maduran en nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos recién formados no solamente permiten un crecimiento continuado del tumor primario, sino también la diseminación y recolonización de células tumorales metastásicas. Por consiguiente, se ha observado una co-relación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y supervivencia del paciente en cáncer de mama así como en otros tumores varios. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 34:112-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 34:145-146 (1992). Los mecanismos precisos que controlan el cambio angiogénico no están bien comprendidos, pero se cree que la neovascularización de la masa tumoral resulta del balance neto de una multitud de estimuladores e inhibidores de angiogénesis (Folkman, 1995, Nat Med 1 (1 ):27-31).

El proceso de desarrollo vascular está estrictamente regulado. Hasta la fecha, una cantidad significativa de moléculas, principalmente factores secretados producidos por células adyacentes, han demostrado regular la diferenciación, proliferación, migración y coalescencia de EC en estructuras tipo cordón. Por ejemplo, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) se ha identificado como el factor clave implicado en la estimulación de la angiogénesis y en la inducción de la permeabilidad vascular. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). El hallazgo de que la pérdida de incluso un único alelo de VEGF provoca letalidad embrionaria apunta hacia un papel irremplazable desempeñado por este factor en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular. Además, el VEGF ha demostrado ser un mediador clave de la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares. Ferrara et al., Endocr. Rev. supra. El ARNm de VEGF se sobreexpresa por la mayoría de los tumores humanos examinados. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cáncer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cáncer 73:931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:129-139 (1995).

Además, los niveles de concentración de VEGF en fluidos oculares están altamente correlacionados con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatías diabéticas y otras retinopatías

relacionadas con isquemia. Aiello et al., N. Engl. J. Med 331:148-1487 (1994). Además, estudios han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroideas en pacientes afectados por AMD. López et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996).

Anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una diversidad de líneas celulares de tumor humano en ratones desnudos (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstróm et al., Cáncer Res. 56:432-439 (1996); Melnyk et al., Cáncer Res. 56:921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos isquémicos de la retina. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Por lo tanto, anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores y diversos trastornos neovasculares intraoculares. Dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento EP 817.648 publicado el 14 de enero de 1998; y en el documento W98/45331 y el documento W98/45332, ambos publicados el 15 de octubre de 1998. Uno de los anticuerpos anti-VEGF, bevacizumab, se ha aprobado por la FDA para su uso en combinación con un régimen quimioterapéutico para tratar cáncer colorrectal metastásico (CRC) y cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC). Y bevacizumab se está investigando en muchos ensayos clínicos en curso para tratar diversas indicaciones cancerosas.

Durante el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas envían axones tipo cable que migran sobre largas distancias para alcanzar sus dianas. Véase la revisión de Carmeliet y Tessier-Lavigne (25) Nature 436:193-2. En la punta principal de un axón en crecimiento está una estructura sensorial de alta motilidad llamada cono de crecimiento. A través de ciclos dinámicos de extensión y retracción de extensiones filopodiales, el cono de crecimiento detecta y evalúa de forma continua una miríada de señales de guía en su entorno espacial, y selecciona de forma precisa una vía correcta para la extensión hacia su diana final.

En la pasada década, se han hecho considerables progresos en la comprensión de los mecanismos de guía de axones. Véase la revisión de Dickson (22) Science 298:1959-64. Las señales de guía se presentan en cuatro variedades: atrayentes y repelentes; que pueden actuar en corto alcance (es decir, asociadas a células o matriz) o en largo alcance (es decir, difusible). Hasta ahora, se han identificado cuatro familias principales de moléculas guía de axones: las netrinas, semaforinas, efrinas y slits. Véase la revisión de Huber et al (23) Annu Rev Neurosci 26:59-63.

Las semaforinas (Sema) también llamadas colapsinas, pertenecen una gran familia de proteínas secretadas filogenéticamente conservadas y asociadas a membrana. Los miembros de la familia de semaforina son capaces de mediar eventos de guía de axones tanto repulsivos como atrayentes durante el desarrollo neural. Raper (2) Curr... [Seguir leyendo]

1. Un cristal de un complejo formado entre un fragmento Nrp2aia2bib2 y un fragmento Fab de anticuerpo anti-panlSlrpA que inhibe la unión de semaforina a Nrp2, en donde dicho cristal difracta radiación de rayos X para producir un patrón de difracción que representa la estructura tridimensional de dicho complejo, que tiene aproximadamente las siguientes constantes de celda:

a=148 Á, 6=16 Á, c=92,4 Á, y un grupo espacial de C2; o a=121 Á, b=121 Á, c=23 Á, y un grupo espacial de P3221.

2. Un anticuerpo anti-panNrpA o un fragmento de anticuerpo que comprende:

(a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera mostrada en la Figura 7 y/o una secuencia de dominio variable de cadena pesada mostrada en la Figura 8; o

(b) las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 mostradas en la Figura 7 y las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 mostradas en la Figura 8.

3. Un anticuerpo anti-panNrpA YW68.11, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia mostrada en la Figura 9A.

4. Un anticuerpo anti-panNrpA YW68.11.26, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia mostrada en la Figura 9B.

5. El fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti-panNrpA de las reivindicaciones 3 o 4, que se selecciona entre el grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, anticuerpo lineal, molécula de anticuerpo de cadena sencilla, minicuerpo, diacuerpo y anticuerpo multiespecífico.

6. El fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti-panNrpA de la reivindicación 5, en donde el fragmento de unión a antígeno es biespecífico.

7. El anticuerpo anti-panNrpA de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab.

8. Un anticuerpo anti-Nrp que compite por la unión a Nrp con el anticuerpo anti-panNrpA de acuerdo con la

reivindicación 2.

9. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 8 que se une esencialmente al mismo epítopo que el anticuerpo antipan NrpA.

1. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 8 que se une a un epítopo que comprende al menos parte de una interfaz definida por los restos de aminoácido Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 y R138 de la secuencia de aminoácidos de Nrp2aia2bib2-

11. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 8 que se une tanto a Nrp 1 como a Nrp2.

12. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 11 que tiene una afinidad de unión de al menos aproximadamente ,1 nM, ,15 nM, ,2 nM, ,25 nM o ,3 nM tanto para Nrp1 como para Nrp2.

13. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 11 que bloquea la unión de Sema3 tanto a Nrp1 como a Nrp2.

14. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 13 que no bloquea la unión de VEGF a Nrp1 o Nrp2.

15. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 13 o de la reivindicación 14 que inhibe la actividad biológica de semaforina in vitro o in vivo.

16. El anticuerpo anti-Nrp de una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, que es un anticuerpo multiespecífico.

17. El anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 16, que es biespecífico.

18. El anticuerpo anti-Nrp de una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, que es un anticuerpo monoclonal de longitud completa.

19. El anticuerpo anti-Nrp de una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, que es un fragmento de anticuerpo.

2. El fragmento de anticuerpo anti-Nrp de la reivindicación 19, que es un Fv, Fab, F(ab')2 o scFv.

21. Un método para preparar un antagonista de semaforina, que comprende diseñar una molécula de unión a un sitio que comprende al menos parte de una interfaz definida por los restos de aminoácido Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73, P74, H75, F76, A133 y R138 de la secuencia de aminoácidos de Nrp2aia2bib2, sintetizar dicho compuesto y confirmar que dicho compuesto bloquea la unión de semaforina a Nrp1 y Nrp2.

22. El método de la reivindicación 21 en el que dicho antagonista no interfiere con la unión de VEGF a Nrp1 o Nrp2.

23. El método de la reivindicación 22 que comprende adicionalmente la etapa de confirmar que dicho antagonista no interfiere con la unión de VEGF a Nrp1 o Nrp2.

24. El método de la reivindicación 22 que comprende adicionalmente la etapa de confirmar que dicho antagonista no interfiere con la actividad biológica de VEGF.

25. El método de la reivindicación 21 en el que dicho antagonista se selecciona entre el grupo que consiste en 15 anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, polipéptidos de unión, péptidos y moléculas pequeñas no peptídicas.

26. El método de la reivindicación 25 en el que dicho antagonista es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

27. El método de la reivindicación 26 en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona entre el grupo que 2 consiste en Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, anticuerpo lineal, molécula de anticuerpo de cadena sencilla,

minicuerpo, diacuerpo y anticuerpo multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticuerpo.

TABLA 1