Enterotoxina termolábil de E. coli mutada.

Un polipéptido aislado que comprende una subunidad A de enterotoxina termolábil de E.

coli, teniendo la subunidad A de enterotoxina termolábil de E. coli una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8, y 10, en donde una enterotoxina termolábil de E. coli que contiene la subunidad A que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de el grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8 y 10 tiene una toxicidad reducida en comparación con una enterotoxina termolábil de E. coli de tipo salvaje que contiene el SEQ ID NO: 5.

Enterotoxina termolábil de E. coli mutada Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 11/779.419 Presentada el 18 de Julio.

Antecedentes

Las cepas de Escheríchia coli enterotoxigénicas causan diarrea en seres humanos y animales domésticos mediante la producción de dos tipos de enterotoxinas, esto es, la toxina termolábil (LT) y la toxina termoestable (ST) (Hofstra et al., 1984, J. Bio. Chem. 259:15182-15187). La LT está funcionalmente, estructuralmente, e inmunológicamente relacionada con la toxina del cólera (CT) (Clements et al., 1978, Infect. Immun. 21:136-39). La LT y la CT se sintetizan como moléculas de holotoxina integradas por cinco subunidades B idénticas y una subunidad A enzimáticamente activa (AB5) (Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). El pentámero de B se une al gangliósido GM1 en la membrana de las células epiteliales intestinales o cualquier otra célula que contenga GM1 (van Heyningen, 1974, Science 183:656-657). Después de la unión de las subunidades B a GM1 en la superficie celular, la subunidad A es insertada en el citosol y escindida proteolíticamente y reducida en su único enlace disulfuro para producir un péptido A1 enzimáticamente activo y un péptido A2 más pequeño (Fishman PH, 1982, J. Membr. Biol. 69: 85-97; Mekalanos et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 5855-5861; Moss et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:12861-12865). El péptido A1 es capaz de unirse a NAD y catalizar la ADP-ribosilación de Gsa, una proteína reguladora de unión a GTP asociada con adenilato ciclasa (Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). El incremento resultante de AMPc finalmente conduce a la liberación de electrolitos y fluidos desde las células afectadas (Cheng et al., 2, Vaccine, 18:38-49).

Se ha demostrado que LT funciona como coadyuvante mucosal e induce respuestas inmunitarias contra antlgenos administrados simultáneamente por vía mucosal (Clements et al., 1988, Vaccine, 6:269-277; Elson CO. 1989, Immunol. Today 146:29-33; Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4): 622-647). Sin embargo, la alta toxicidad de la LT de tipo salvaje ha limitado su uso clínico. Por lo tanto, es deseable generar LT mutadas que tengan toxicidad reducida al tiempo que conservan su inmunogenicidad.

El término "enterotoxina termolábil de E. coli" o "LT" según se utiliza en la presente memoria se refiere a una enterotoxina termolábil producida por cualquier cepa de E. coli enterotoxigénica. El término "subunidad A de enterotoxina termolábil de E. coli " o "LTA" se refiere a la subunidad A de LT. Incluye tanto la LTA precursora, que contiene un péptido señal, como la LTA madura que tiene el péptido señal eliminado.

Compendio

Esta invención se basa en el descubrimiento Inesperado de que una LT que contiene una LTA mutada muestra toxicidad reducida en comparación con su contraparte de tipo salvaje a la vez que mantiene la inmunogenicidad. Esta LTa mutada tiene una sustitución de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 61 de una LTA de tipo salvaje, cuya secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 5, se muestra a continuación.

Por consiguiente, esta invención caracteriza un polipéptido aislado que incluye una LTA mutada que contiene un residuo de aminoácido distinto de S, T, y F, en la posición correspondiente a la posición 61 del SEQ ID NO: 5. El residuo de aminoácido de sustitución puede ser D, E, H, I, K, L, N, P, Q, R, Y o W. Puede ser un aminoácido de origen natural o un aminoácido de origen no natural, por ejemplo, un D-amlnoácido o un p-amlnoácldo. En un ejemplo, la LTA tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, 4, 8 o 1. Una LT que contiene esta LTA mutada muestra toxicidad reducida, esto es, <1'5 veces la de una LT de tipo salvaje que contiene el SEQ ID NO: 5.

En otro aspecto, esta invención caracteriza una vacuna que contiene un antígeno y la LTA mutada descrita más arriba. La vacuna puede incluir adicionalmente la subunidad B de LT, que forma con la LTA mutada la proteína LT completa. El antígeno puede derivar de una bacteria o de un virus.

En otro aspecto más, esta invención caracteriza un ácido nucleico aislado que incluye una secuencia de nucleótldos que codifica la LTA mutante descrita anteriormente. En un ejemplo, la secuencia de nucleótldos tiene los SEQ ID NO: 1, 3, 7, o 9. También está dentro del alcance de esta invención un vector que incluye el ácido nucleico que se acaba de describir y una célula transformada que contiene el vector.

Los detalles de una o más realizaciones de la Invención se exponen en la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones.

Descripción detallada

Una LT destoxificada, p. ej., que contiene una LTa mutada, es un coadyuvante de vacuna deseado debido a su alta inmunogenicidad. La LTa mutada de esta invención, diseñada para lograr este propósito, se prepara mediante la introducción de una sustitución de aminoácido en una LTa en una posición correspondiente a la posición 61 del SEQ ID NO: 5. Las LTa producidas por diferentes cepas de E. coli enterotoxigénicas son altamente homologas. Por lo tanto, mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos de una LTa con el SEQ ID NO: 5, un experto en la técnica puede averiguar qué posición en esta LTa corresponde a la posición 61 del SEQ ID NO: 5. Al igual que la LTa del SEQ ID NO: 5, casi todas las LTa de tipo salvaje incluyen una serina en la posición correspondiente a la posición 61 del SEQ ID NO: 5. Se puede utilizar como sustituyente un aminoácido que sea diferente de la serina, por ejemplo, en tamaño o polaridad. Los ejemplos de los aminoácidos sustituyentes incluyen residuos de aminoácidos hidrófobos (p. ej., I y L), cargados de residuos de aminoácidos (p. ej., D, E, K, R y H), o residuos de aminoácidos con cadenas laterales voluminosas (p. ej., N, Q, Y, y W). La prolina también se puede utilizar como sustituyente ya que generalmente altera la estructura local de un polipéptido. Estos aminoácidos sustituyentes incluyen aminoácidos de origen no natural, por ejemplo, D-aminoácidos o (3-aminoácidos.

La LTa muíante de esta invención se puede preparar por medio de métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el muíante se produce mediante un método recombinante como sigue. Un ADNc que codifica una LTa de tipo salvaje se aísla de una cepa enterotoxigénica de E. coli y se somete a mutagénesis dirigida al sitio para producir un ADNc que codifica la LTa deseada muíante. Véase Ho et al., Gene, 77: 51-59,1989. El ADNc que porta la mutación a continuación, se inserta en un vector de expresión para la transformación de células. Por último, la LTa mutante producida en las células transformadas se purifica y se ensamblado con la subunidad B de LT para formar la protema LT completa.

La toxicidad de una LT que contiene un mutante de LTa descrito anteriormente se puede evaluar utilizando análisis tales como el análisis de células suprarrenales Y-1. Véase Cheng et al., Vaccine, 18:38-49, 2.

El mutante de LTa de esta invención se puede utilizar como coadyuvante en una vacuna. La vacuna (es decir, una vacuna humana o una vacuna veterinaria) puede contener un antígeno y el propio mutante de LTa o una LT que contiene el mutante de LTa. El antígeno puede derivar de una bacteria, p. ej., Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neiseria gonorrea, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Chlamydia spp., Helicobacter pylori. También puede derivar de un virus, p. ej., influenza, virus herpes simplex, virus de la inmunodeficiencia humana, citomegalovirus, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis delta, poliovirus, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela zoster, virus respiratorio sincitial, enterovirus o virus de la encefalitis japonesa.

La vacuna puede contener adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato o una disolución de bicarbonato. El vehículo se selecciona basándose en el modo y la ruta de administración, y la práctica farmacéutica convencional. Los vehículos... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende una subunidad A de enterotoxina termolábil de E. coli, teniendo la subunldad A de enterotoxina termolábil de E. coli una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8, y 1, en donde una enterotoxina termolábil de E. coli que contiene la subunidad A que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de el grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8 y 1 tiene una toxicidad reducida en comparación con una enterotoxina termolábil de E. coli de tipo salvaje que contiene el SEQ ID NO: 5.

2. Una vacuna que comprende un antígeno y un coadyuvante, siendo el coadyuvante una subunldad A de la enterotoxina termolábil de E. coli, teniendo la subunidad A de la enterotoxina termolábil de E. coli mutada una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8, y 1, en donde una enterotoxina termolábil de E. coli que contiene la subunidad A que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8 tiene una toxicidad reducida en comparación con una enterotoxina termolábil de E. coli de tipo salvaje que contiene el SEQ ID NO: 5.

3. La vacuna de la Reivindicación 2, en donde el antígeno es de una bacteria o un virus.

4. La vacuna de la Reivindicación 3, en donde la bacteria se selecciona de un grupo que consiste en Streptococcus pneumoniae, Escherlchla coli, Helicobacter pylorl, Neisserla meningitidis, y Haemophilus influenza b, y en donde el virus se selecciona de un grupo que consiste en virus Influenza, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del papiloma humano, enterovirus, y rotavlrus.

5. La vacuna de cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 4, que comprende adicionalmente la subunldad B de LT, en donde el mutante de la subunldad A y la subunldad B forman la enterotoxina termolábil de E. coli completa.

6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunldad A de la enterotoxina termolábil de E. coli, teniendo la subunldad A de la enterotoxina termolábil de E. coli una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8, y 1, en donde la enterotoxina termolábil de E. coli que contiene la subunidad A que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 4, 8 tiene una toxicidad reducida en comparación con una enterotoxina termolábil de E. coli de tipo salvaje que contiene el SEQ ID NO: 5.

7. El ácido nucleico de la Reivindicación 6, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 3, 7, y 9.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las Reivindicaciones 6 o 7.

9. Una célula transformada que comprende el vector de la Reivindicación 8.