Ensayos de diagnóstico para parvovirus B19.

Método para detectar infección por parvovirus B19 humano en una muestra biológica,

comprendiendo dicho método:

(a) aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica sospechosa de comprender ADN de parvovirus B19 humano, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia diana;

(b) amplificar la secuencia diana utilizando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa de 5' a 3', un par de cebadores capaces de hibridarse a la secuencia diana, y una sonda de oligonucleótidos diseñada para hibridar en 3' en relación a uno de los cebadores dentro de la secuencia amplificada, en la que

(i) dicho par de cebadores comprende un cebador sentido de SEQ ID NO:88 y un cebador antisentido de SEQ ID NO:89;

(ii) el extremo 5' de la sonda comprende un colorante informador fluorescente, y el extremo 3' de la sonda está bloqueado para evitar la extensión de la sonda y comprende un colorante que desactiva la fluorescencia del fluoróforo en 5'.

(iii) durante la amplificación la polimerasa digiere la sonda de oligonucleótidos cuando se hibrida a la secuencia diana, separando de este modo la molécula informadora de la molécula desactivadora; y

(iv) a medida que tiene lugar la amplificación, se monitoriza la fluorescencia de la molécula informadora, correspondiendo la fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico.

Ensayos de diagnóstico para parvovirus B19 Sector técnico

La presente invención se refiere en general a los diagnósticos virales. En particular, la presente invención se refiere a ensayos a base de ácido nucleico para diagnosticar de manera exacta la infección por parvovirus B19 y a los cebadores y sondas para su utilización en estos ensayos.

Antecedentes de la invención

El parvovirus B19 humano es un miembro de la familia Parvoviridae, género Erythrovirus y es un virus sin envoltura ¡cosaédrico de 22 nm pequeño, con una molécula de ADN de una sola hebra lineal de aproximadamente 5.6 nucleótidos. El genoma viral codifica tres proteínas principales, VP1, VP2 y NS1. Véase, hade y otros, J. Virol. (1986) 58:921-936 y la figura 1 en el presente documento. VP1 (83 kDa) y VP2 (58 kDa) son las proteínas estructurales de la cápside. Las dos proteínas son codificadas en marcos de lectura superpuestos desde aproximadamente los nucleótidos 2444 hasta 4789 y aproximadamente 3125 hasta 4789, respectivamente. VP2 constituye el 95% de la cápside y la proteína VP1 más grande solamente el 5% de la cápside. VP1 es requerido para la conformación madura del virus. NS1 (77 kDa), es una proteína no estructural y está presente solamente en la fracción nuclear de las células infectadas y ausente del citoplasma y los viriones intactos en el suero.

El parvovirus B19 fue descubierto primero en el suero de los donadores de sangre normales y es el único miembro de la familia Parvoviridae que se sabe que es patógeno para los seres humanos. El virus está asociado con una amplia gama de manifestaciones de la enfermedad. El parvovirus B19 humano normalmente provoca una infección autolimitante suave o asintomática en los niños. En los adultos, el parvovirus B19 provoca un salpullido, poliartralgia simétrica transitoria y artritis. El parvovirus B19 ha sido asociado con la crisis aplástica transitoria (TAC) (por sus siglas en inglés) en pacientes con trastornos hemolíticos subyacentes. La infección por B19 crónica y anemia persistente han sido reportados en pacientes ¡nmunocomprometidos con leucemia aguda, inmunodeficiencias congénitas, SIDA, y a continuación del trasplante de médula ósea. El parvovirus B19 también ha sido asociado con la muerte fetal en las mujeres embarazadas.

En la mayor parte de los países, la infección con el virus B19 ocurre generalmente durante la niñez, teniendo aproximadamente el 5% de los niños anticuerpos anti-B19 a la edad de 15 años. La frecuencia del anticuerpo B19 puede incrementarse adicionalmente durante la vida y alcanza valores más elevados que el 9% en individuos ancianos.

En la infección por parvovirus B19 humano, la replicación viral inicial se cree que ocurre en el tracto respiratorio. El virus entonces tiene como diana las células en la médula ósea. Esto conduce a replicación viral en gran escala con viremia informada desde 12 hasta 114 partículas/ml, que ocurre a los 7-1 días después de la infección pero previo al inicio de los síntomas. El cese de la viremia coincide con la detección de anticuerpos de IgM específicos que permanecen elevados durante dos a tres meses. Los anticuerpos de IgG anti-B19 son detectados a los pocos días después que los anticuerpos IgM aparecen y persisten toda la vida.

La ausencia de una envoltura de lípido y el contenido de ADN limitado hace al parvovirus B19 extremadamente resistente a la inactivación fisicoquímica. El parvovirus B19, especialmente a alta concentración, puede resistir el tratamiento con calor convencional de los productos sanguíneos y se ha documentado la transmisión de B19 a través de la administración del factor VIII tratado con solvente-detergente y las preparaciones del factor VIII y IX calentadas con vapor o en seco.

El parvovirus B19 humano no se puede hacer crecer en los cultivos celulares convencionales haciendo extremadamente difícil la detección y aislamiento del virus en el laboratorio. Por consiguiente, durante muchos años, la única fuente de antígeno consistió en suero de los pacientes vlrémicos. Los antígenos recomblnantes han sido producidos para su utilización en los ensayos serológlcos en un Intento de evitar estos problemas. Véase, por ejemplo, Slsky Berman, Biotechnology (1987) 5:177-18; patente de Estados Unidos No. 6.24.44. Los ensayos de captura de IgM ¡nmunoenzimática han sido utilizados para detectar IgM anti-B19, así como para diagnosticar la infección por B19 reciente. El funcionamiento de diagnóstico de un número de pruebas disponibles comercialmente, sin embargo, no es homogéneo. Además, las pruebas de diagnóstico a base de IgM, no pueden detectar el virus durante la etapa virémica de infección y una vez que los anticuerpos de IgM son sintetizados, los mismos pueden permanecer en circulación durante varios meses después del fin de la viremia.

La alta frecuencia de los anticuerpos de B19 en la población normal junto con el hecho de que la viremia elevada habitualmente persiste durante solo una semana, hace que la utilización de las pruebas de base serológica no sea práctico. Además, en pacientes ¡nmunocomprometidos, el diagnóstico serológico puede ser no fiable.

Los ensayos de hibridación a base de ácido nucleico, tales como la transferencia por puntos y la hibridación in situ

han sido utilizados para la detección de B19. Estos ensayos generalmente tienen límites de detección de 1 hasta ,1 pg de ADN viral (~14-15 partículas virales). La PCR tiene una sensibilidad mayor (-1 copias del genoma). Sin embargo, las técnicas de hibridación del ADN consumen mucho tiempo y son de utilización limitada y la PCR no es práctica para el cribado de números elevados de muestras.

Por lo tanto, subsiste una necesidad para el desarrollo de pruebas de diagnóstico fiables para detectar el parvovirus B19 en las muestras virémicas, para prevenir la transmisión del virus a través de la sangre y los derivados del plasma o por contacto personal estrecho.

Características de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de sondas y cebadores únicos para su utilización en ensayos a base de ácido nucleico, así como en el desarrollo de una prueba de diagnóstico a base de ácidos nucleicos, fiable, sensible, para la detección del ADN del parvovirus B19 en las muestras biológicas de individuos infectados potencialmente. Las técnicas descritas en el presente documento utilizan el ADN de la muestra extraída como un molde para la amplificación de las regiones genómicas conservadas de la secuencia de B19 utilizando la amplificación mediada por transcripción (TMA) (por sus siglas en inglés), así como en un ensayo de nucleasa 5, tal como la técnica de TaqMan. Los métodos permiten la detección del ADN de B19 en las muestras virémicas que tienen concentraciones virales tan bajas como 13 partículas del virus/ml. En consecuencia, las muestras infectadas pueden ser identificadas y excluidas de la transfusión, así como de la preparación de derivados de la sangre.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención está dirigida a un método de detección de la infección por parvovirus B19 humano en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) aislar el ácido nucleico de una muestra biológica sospechosa de contener el ADN de parvovirus B19 humano, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia diana;

(b) amplificar la secuencia diana utilizando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nuclease de 5 a 3, un par de cebadores capaz de hibridarse a la secuencia diana y una sonda de oligonucleótido diseñada para hibridarse en 3 con respecto a uno de los cebadores dentro de la secuencia amplificada,

en el que

(i) dicho par de cebadores comprenden un cebador sentido de la SEQ ID NO:88 y un cebador antisentido de

SEQ ID NO:89;

(¡i) el extremo 5 de la sonda comprende un colorante informador fluorescente, y el extreme 3 de la sonda está bloqueado para evitar la extensión de la sonda y comprende un colorante que desactiva la fluorescencia del fluoróforo en 5;

(i¡¡) durante la amplificación la polimerasa digiere la sonda de oligonucleótidos cuando se híbrida a la secuencia diana, separando de este modo la molécula informadora de la molécula desactivadora; y (iv) a medida que tiene lugar la amplificación, se monitoriza la fluorescencia de la molécula informadora, correspondiendo la fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico.

En otra realización, la invención se dirige a un método para detectar infección por parvovirus B19 humano en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) aislar el ácido nucleico de una muestra biológica sospechosa de contener... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar infección por parvovirus B19 humano en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica sospechosa de comprender ADN de parvovirus B19 humano, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia diana;

(b) amplificar la secuencia diana utilizando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa de 5 a 3, un par de cebadores capaces de hibridarse a la secuencia diana, y una sonda de oligonucleótidos diseñada para hibridar en 3 en relación a uno de los cebadores dentro de la secuencia amplificada,

en la que

(i) dicho par de cebadores comprende un cebador sentido de SEQ ID NO:88 y un cebador antisentido de SEQ ID NO:89;

(ii) el extremo 5 de la sonda comprende un colorante informador fluorescente, y el extremo 3 de la sonda está bloqueado para evitar la extensión de la sonda y comprende un colorante que desactiva la fluorescencia del fluoróforo en 5.

(iii) durante la amplificación la polimerasa digiere la sonda de oligonucleótidos cuando se híbrida a la secuencia diana, separando de este modo la molécula informadora de la molécula desactivadora; y

(iv) a medida que tiene lugar la amplificación, se monitoriza la fluorescencia de la molécula informadora, correspondiendo la fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el informador es un colorante de fluoresceína.

3. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el desactivador es un colorante de rodamina.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha polimerasa de ácido nucleico es una polimerasa Thermus aquaticus (Taq).

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de aislamiento comprende la reasociación del ácido nucleico a un oligonucleótido de captura específico de diana, en el que el oligonucleótido de captura tiene una secuencia de polinucleótidos seleccionada SEQ ID No:49-55.

6. Método para detectar infección por parvovirus B19 humano en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) aislar ácido nucleico de una muestra biológica sospechosa de contener ADN de parvovirus B19 humano, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia diana;

(b) hacer reaccionar el ácido nucleico de parvovirus B19 humano con un primer oligonucleótido que comprende un primer cebador que comprende una secuencia de formación de complejo suficientemente complementaria a la parte 3 terminal de la secuencia diana con la que va a formar el complejo, en la que el primer cebador comprende adicionalmente un promotor para una ARN polimerasa en 5 dependiente de ADN y está unido operativamente a la secuencia de formación de complejo, en la que la reacción se realiza bajo condiciones que proporcionan la formación de un complejo oligonucleótido/secuencia diana y la iniciación de la síntesis de ADN;

(c) extender el primer cebador en una reacción de extensión utilizando la secuencia diana como molde para dar un primer producto de extensión del cebador de ADN complementario a la secuencia diana;

(d) tratar el producto de extensión del cebador de ADN con un segundo oligonucleótido que comprende un segundo cebador que comprende una secuencia de formación de complejo suficientemente complementaria a la parte 3 terminal del producto de extensión del cebador de ADN para formar un complejo con él, bajo condiciones que proporcionan la formación de un complejo oligonucleótido/secuencia diana y la iniciación de la síntesis de ADN;

(e) extender el extremo 3 terminal del segundo cebador en una reacción de extensión de ADN para dar un segundo producto de extensión de cebador de ADN, produciendo de este modo un molde para la ARN polimerasa dependiente de ADN;

(f) utilizar el molde para producir múltiples copias de ARN de la secuencia diana utilizando ARN polimerasa dependiente de ADN que reconoce la secuencia promotora; y

(g) repetir de forma autocatalítica las etapas (b) a (f) utilizando las copias de ARN de la etapa (f) para amplificar la secuencia diana, en el que dicho primer y segundo cebadores tienen la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID No:88 y 89.

7. Método, según la reivindicación 6, que comprende adicionalmente las etapas de:

(i) añadir una sonda de oligonucleótido etiquetada al producto de la etapa (f), en el que la sonda de oligonucleótido es complementaria a una parte de la secuencia diana, bajo condiciones que proporcionan la hibridación de la sonda con la secuencia diana para formar un complejo sonda:diana; y

(j) detectar la presencia o ausencia de una etiqueta como indicación de la presencia o ausencia de la secuencia diana.

8. Método, según la reivindicación 7, en el que la etiqueta es un éster de acridinio.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además proporcionar un control interno.

1. Método, según la reivindicación 9, en el que el control interno comprende la SEQ ID No:9.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que permite la detección del ADN de B19 en muestras virémicas que tienen títulos virales tan bajos como de 13 partículas de virus/ml.