Endoglucanasa originada a partir de zigomicetos que carece del dominio de enlace a celulosa.

Una proteína que es una endoglucanasa que carece del dominio de enlace a celulosa de la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de Zygomycetes y que exhibe actividad endoglucanasa,

en donde la proteína tiene al menos dos veces mayor actividad de eliminación de la pelusa de tejidos que contienen celulosa de la proteína original que tiene el dominio de enlace a celulosa y en donde es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, en donde el dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, y que exhibe actividad endoglucanasa, o es una proteína modificada de la misma que exhibe actividad endoglucanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con dicha secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, en donde el dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11.

Endoglucanasa originada a partir de zigomicetos que carece del dominio de enlace a celulosa Campo técnico

La presente Invención se refiere a una enzima endoglucanasa, cuyo dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido, con efectos mejorados en el tratamiento de tejidos que contienen celulosa y con aplicaciones relacionadas con detergentes o pasta de papel, un método para producir la misma, y una preparación de celulasa con efectos mejorados.

Antecedentes de la técnica

El tratamiento de tejidos que contienen celulosa con celulasa se lleva a cabo para proporcionarle a los tejidos propiedades deseadas. Por ejemplo, el tratamiento con celulasa se realiza en la Industria textil con el fin de mejorar la sensación al tacto y la apariencia de los tejidos que contienen celulosa o para dar a los tejidos coloreados que contienen celulosa un aspecto de material "lavado a la piedra", es decir, cambio parcial del color ( Patente Europea No. 307.564).

Se sabe que los textiles que contienen celulosa teñida forman pelusa después de lavados repetidos y pierden su viveza. La incorporación de celulasa en un detergente puede quitar la pelusa y hacer que el color de los tejidos sea más vivo, es decir, aclara el color (Patente Europea No. 220.016). Por lo tanto, los detergentes que contienen celulasa se encuentran comercialmente disponibles, principalmente en Europa y América.

En la solicitud antes mencionada, se usan principalmente celulasas derivadas de ír/choderma o Hum/co/a (ambos son hongos que pudren la madera). Las preparaciones de celulasa utilizadas recientemente se producen mediante el aislamiento de endoglucanasas, que son muy activas en el tratamiento de tejidos, a partir de estos componentes de celulasa y mejoran sus efectos mediante ingeniería genética con el fin de mejorar la eficiencia comercial. Ejemplos de estas endoglucanasas altamente activas incluyen: EG V derivada de Hum/co/a /nso/ens (WO 91/17243) y NCE4 (WO 98/03640) que actúan fuertemente en tejidos de algodón; y RCE I, RCE II, y RCE III derivadas de Rñ/zopus oryzae, MCE I y MCE II derivadas de /Wucor c/rc/ne//o/des, y PCE I derivada de Pñycomyces n/fens (WO 00/24879) que actúan fuertemente en telas de llocel.

Entre las endoglucanasas utilizadas en las aplicaciones mencionadas, se presume que EG V (WO 91/17243), NCE4 (WO 98/03640), y RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II, y PCE I (WO 00/24879) pertenecen a la misma familia (familia 45) a causa de sus secuencias de aminoácidos, y estas enzimas tienen propiedades estructurales comunes. Específicamente, cada una de estas endoglucanasas comprende un dominio de enlace a celulosa para unión a la celulosa como su sustrato (en lo sucesivo denominado "DEC"), un dominio catalítico activo como un centro activo (denominado en lo sucesivo "DCA"), y un dominio enlazador con un alto contenido de residuos de aminoácidos hidrofílicos para el enlazamiento de estos dos dominios.

EG V, una endoglucanasa que pertenece a la familia 45, fue estudiada usando una enzima, cuyo dominio DEC había sido suprimido (publicación de la patente japonesa (traducción PCT) No. 9-500667, y Enzyme and Microbial Technology, 27 (2000), 325-329). Sin embargo, no se ha reportado ninguna mejora con respecto a la actividad endoglucanasa para quitar la pelusa de las telas de celulosa a través de la eliminación del dominio de enlazamiento a celulosa (DEC). Todavía hay muchas cuestiones sin aclarar relativas al papel del dominio de enlace a celulosa de la endoglucanasa en la exposición de la actividad endoglucanasa, y la investigación de los mismos está limitada a la celulasa derivada de un hongo específico, a saber, Tr/cñoderma (Klovula, A. y colaboradores, Trichoderma Gliocladium, 2, (1998), 3-23). No ha habido una investigación detallada sobre el dominio de enlace a celulosa de la endoglucanasa derivada de Zygomycefes.

Hasta el presente, se han desarrollado varias estratagemas con el fin de mejorar el efecto o el desempeño de la celulasa en las aplicaciones anteriores. Por ejemplo, se aplicó una mutación a una enzima para mejorarla, o se modificaron las condiciones de cultivo con el fin de mejorar la productividad de la enzima. Sin embargo, debido al alto coste de celulasa que se va a utilizar, se debe mejorar aún más el efecto de la celulasa con el fin de proporcionar una preparación de celulasa que valga la pena utilizar a nivel industrialmente práctico. Las preparaciones de celulasa utilizadas recientemente se producen reforzando únicamente la endoglucanasa, que es altamente activa en el tratamiento de tejidos, mediante ingeniería genética con el fin de mejorar la eficiencia comercial. Por consiguiente, es deseable mejorar aún más la actividad de tal celulasa altamente activa.

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una endoglucanasa con actividad mejorada, una preparación de celulasa que la contenga, y diferentes métodos para el tratamiento de tejidos que contienen celulosa utilizando la misma.

Los presentes inventores han realizado estudios concentrados en la endoglucanasa derivada de Zygomycetes relacionados con el papel de un dominio de enlace a celulosa cuando actúa sobre tejidos que contienen celulosa. Como resultado, han encontrado que una endoglucanasa que carece del dominio de enlace a celulosa tiene mucho mayor actividad de eliminación de pelusa de algodón, liocel, o similares, en comparación a una endoglucanasa que tiene un dominio de enlace a celulosa. Esto llevó a la culminación de la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a una endoglucanasa de Zygomycetes (algunas veces llamada aquí como endoglucanasa derivada de Zygomycetes) que tiene efectos mejorados para la eliminación de pelusa de los tejidos que contienen celulosa (por ejemplo, una enzima que comprende secuencias de aminoácidos de RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II, y PCE I, que alcanza mejores efectos de eliminación de pelusa de los tejidos que contienen celulosa a través de la supresión del dominio de enlace a celulosa, y que exhibe actividad endoglucanasa, una proteína modificada de la misma que muestra actividad endoglucanasa y una preparación de celulasa que comprende tal endoglucanasa. La presente invención se refiere también a una endoglucanasa que fue producida en una célula huésped transformada con un gen que codifica tal endoglucanasas, y se refiere además a un método para tratar tejidos que contienen celulosa utilizando la endoglucanasa, que alcanzó una mejor actividad a través de la supresión del dominio de enlace a celulosa o la preparación de celulasa.

Más específicamente, la presente invención incluye lo siguiente.

(1) Una proteína que es una endoglucanasa que carece del dominio de enlace a celulosa de la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de Zygomycetes y que exhibe actividad endoglucanasa, en donde la proteína tiene al menos dos veces mayor actividad de eliminación de pelusa de los tejidos que contienen celulosa que la proteína original que tiene el dominio de enlace a celulosa y en donde es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, en donde el dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, y que exhibe actividad endoglucanasa, o que es una proteína modificada de la misma que exhibe actividad endoglucanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con dicha secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, en donde el dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11.

(2) Una proteína de acuerdo con (1) que se una endoglucanasa perteneciente a la familia 45 que carece del dominio de enlace a celulosa de la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de Zygomycetes y que muestra actividad endoglucanasa.

(3) La proteína de acuerdo con (1) o (2), en donde los Zygomycetes son microorganismos seleccionados del grupo que consta de los que pertenecen a Rh/zopus, Mucory Phycomyces.

(4) La proteína de acuerdo con (3), en donde los Zygomycetes son microorganismos que pertenecen al Rh/zopus.

(5) Un gen que codifica la proteína, o una proteína modificada de la misma, de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (4).

(6) Un vector de expresión que comprende el gen de acuerdo con (5).

(7) Una célula huésped transformada con el vector de expresión de acuerdo con (6).

(8) La célula huésped de acuerdo con (7), que es un hongo filamentoso.

(9) La célula huésped de acuerdo con (8), que es un microorganismo que pertenece a Hum/co/a.

(10) Un método para producir una proteína... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que es una endoglucanasa que carece del dominio de enlace a celulosa de la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de Zygomycetes y que exhibe actividad endoglucanasa, en donde la proteína tiene al menos dos veces mayor actividad de eliminación de la pelusa de tejidos que contienen celulosa de la proteína original que tiene el dominio de enlace a celulosa y en donde es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, en donde el dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, y que exhibe actividad endoglucanasa, o es una proteína modificada de la misma que exhibe actividad endoglucanasa y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con dicha secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11, en donde el dominio de enlace a celulosa ha sido suprimido de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, o 11.

2. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que es una endoglucanasa perteneciente a la familia 45 que carece del dominio de enlace a celulosa de la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de Zygomycetes y que exhibe actividad endoglucanasa.

3. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde los Zygomycetes son microorganismos seleccionados de entre el grupo que consiste de aquellos pertenecientes a Rh/zopus, Mucor y Rhycomyces.

4. La proteína de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los Zygomycetes son microorganismos pertenecientes a Rh/zopus.

5. Un gen que codifica la proteína o proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que comprende el gen de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula huésped transformada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6.

8. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7, que es un hongo filamentoso.

9. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, que es un microorganismo perteneciente a Hum/co/a.

10. Un método para producir una proteína que comprende las etapas de cultivar la célula huésped de acuerdo con una

cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y recolectar, a partir de la célula huésped obtenida por la etapa de cultivar o su

producto de cultivo, la proteína o proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

4.

11. Una proteína producida por el método de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una preparación de celulasa que comprende la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11.

13. Un método para el tratamiento de tejidos que contienen celulosa que comprende una etapa de poner en contacto tejidos que contienen celulosa con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Un método para reducir la velocidad a la que los tejidos que contienen celulosa forman pelusa o la reducción de la formación de pelusa en tejidos que contienen celulosa que comprende una etapa de poner en contacto tejidos que contienen celulosa con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

15. Un método de tratamiento de la pérdida de peso de tejidos que contienen celulosa para mejorar la sensación táctil y la apariencia de los mismos que comprende una etapa de poner en contacto tejidos que contienen celulosa con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

16. Un método de aclaramiento del color de tejidos coloreados que contienen celulosa que comprende una etapa de tratar los tejidos coloreados que contienen celulosa con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

17. Un método para proporcionar tejidos coloreados que contienen celulosa con un cambio parcial de color que comprende una etapa de tratar tejidos coloreados que contienen celulosa con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

18. Un método para reducir la velocidad a la cual los tejidos que contienen celulosa se vuelven rígidos o reducir la rigidez en tejidos que contienen celulosa que comprende una etapa de tratamiento de los tejidos que contienen celulosa con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en donde los tejidos son tratados a través del remojo, lavado, o enjuague de los mismos.

20. Un aditivo para detergente que comprende la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12 en una forma granulada no pulverulenta o una forma líquida estabilizada.

21. Una composición detergente que comprende la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

22. Un método de destintado de papel de desecho usando un agente de destintado en donde la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12 se utiliza en una etapa de destintado de papel de desecho.

23. Un método para mejorar el drenaje de la pasta de papel que comprende una etapa de tratamiento de la pulpa de papel con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.

24. Un método para mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales que comprende una etapa de tratamiento de los alimentos para animales con la proteína o una proteína modificada de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 o la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 12.