Procedimiento para determinar analitos asociados a plaquetas.

Procedimiento para determinar la cantidad o la actividad de un analito asociado a plaquetas en una muestra de un individuo,

caracterizado porque el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) medir la cantidad o la actividad del analito en una primera mezcla básica de prueba que contiene plasma rico en plaquetas del individuo y un detergente y en una segunda mezcla básica de prueba que contiene o bien

i) plasma rico en plaquetas del individuo y ningún detergente o bien

ii) plasma pobre en plaquetas del individuo y ningún detergente o bien

iii) plasma pobre en plaquetas del individuo y un detergente, y

b) comparar los resultados de medición,

correspondiendo la diferencia entre los resultados de medición a la cantidad o a la actividad del analito asociado a plaquetas.

Procedimiento para determinar analitos asociados a plaquetas

La presente invención pertenece al campo del diagnóstico de coagulación y se refiere a un procedimiento in vitro para determinar analitos asociados a plaquetas en una muestra.

Los procesos fisiológicos, que por un lado garantizan la fluidez de la sangre en el sistema vascular y por otro lado garantizan que se eviten pérdidas de sangre extravasculares mediante la formación de coágulos de sangre, se engloban bajo el término hemostasla. En la regulación de la hemostasia participan un gran número de factores proteicos así como componentes celulares, tal como por ejemplo las plaquetas (sinónimos: plaquetas sanguíneas, trombocitos). En el caso de una lesión vascular, en primera lugar se produce la adhesión de plaquetas al colágeno subendotelial. Esta adhesión está mediada por proteínas de adhesión, tal como el factor de von Willebrand (VWF). Durante el proceso de adhesión se activan las plaquetas y se secretan mediadores fuera de sus gránulos, con lo que se induce la agregación de plaquetas adicionales así como un aumento de la activación. De esta manera tiene lugar una obstrucción primaria de las paredes vasculares (hemostasia primaria), que sólo se estabiliza mediante reacciones adicionales del sistema de coagulación plasmático (hemostasia secundaria). Una regulación errónea de estos procesos puede conducir a una propensión a la trombosis o a una propensión a la hemorragia y tener consecuencias potencialmente mortales según el grado de gravedad.

Las plaquetas contienen un gran número de componentes ¡ntracelulares, que tienen funciones fisiológicamente importantes. El sitio de almacenamiento más importante para diferentes sustancias, tal como por ejemplo factor plaquetario 4 (PF4), fibrinógeno, factor V, factor XIII, factor de von Willebrand (VWF), fibronectina, iones calcio así como factores de crecimiento plaquetario, tal como por ejemplo PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), son los gránulos alfa y los gránulos densos en el citoplasma de las plaquetas. Si las plaquetas se activan, por ejemplo como consecuencia de una lesión vascular, los componentes se secretan fuera de los gránulos, con lo que a su vez se ponen en marcha procesos importantes para el curso de la reacción de coagulación. Otras sustancias, tal como por ejemplo el factor XIII, se encuentran en el citosol de las plaquetas. A su vez, otras sustancias están unidas a o sobre la membrana celular de las plaquetas, en particular proteínas receptoras tales como el receptor de ADP, el receptor de tromboxano, el receptor de trombina o las glicoproteínas la, Ib, IIb y Illa. Además, muchas proteínas, tal como por ejemplo factor X, factor IX y factor VIII, se unen como consecuencia de la activación plaquetaria a la membrana celular de las plaquetas. El VWF se une como consecuencia de estrés de cizallamiento o debido a defectos moleculares espontáneamente al receptor GPIb de las plaquetas. Para la proteasa que rompe el VWF, ADAMTS-13, se conoce también un analito asociado a plaquetas.

Muchas de estas sustancias asociadas a plaquetas y su liberación regulada desempeñan un papel importante en la hemostasia. Esto también resulta evidente porque se conocen una serie de cuadros clínicos, que son atribuibles a una alteración de la función de los gránulos en las plaquetas. Una enfermedad conocida es el denominado síndrome de las plaquetas grises (GPS), un trastorno sanguíneo hereditario provocado por gránulos alfa disminuidos o ausentes. Otra enfermedad conocida es el denominado trastorno plaquetario de Quebec (QPD), también un trastorno sanguíneo hereditario, que está provocado por una excesiva degradación de componentes granulares alfa. Por tanto, la identificación de deficiencias o disfunciones de sustancias asociadas a plaquetas o la identificación de defectos en la secreción de estas sustancias fuera de los gránulos de las plaquetas tiene una importancia diagnóstica elevada.

Otra enfermedad conocida es el denominado síndrome de von Willebrand (enfermedad de von Willebrand, VWD), un trastorno sanguíneo hereditario o adquirido. Dado que el síndrome de von Willebrand puede estar provocado por diferentes alteraciones del VWF, se diferencian varios tipos. En el VWD tipo 3 el antígeno del VWF (VWF:Ag) está completamente ausente tanto en el plasma como en los gránulos alfa de las plaquetas. En el VWD de tipo 1, del que es característica una concentración plasmática de antígeno del VWF reducida, se diferencian dos subtipos que se diferencian porque en un subtipo la concentración de antígeno del VWF de los gránulos alfa en las plaquetas también está reducida, mientras que en el otro subtipo la concentración de antígeno del VWF de los gránulos alfa en las plaquetas es normal.

Dado que en los diferentes tipos del síndrome de von Willebrand se utilizan diferentes terapias, cada caso individual requiere una clasificación lo más exacta posible. Por tanto, es deseable determinar no sólo la concentración o la actividad de antígeno del VWF en el plasma de un paciente, sino también la concentración o la actividad de antígeno del VWF en las plaquetas del paciente.

Los procedimientos conocidos para determinar sustancias asociadas a plaquetas son técnicamente complejos y no son adecuados para una ejecución rutinaria en el laboratorio clínico. Básicamente resulta problemático que muchas sustancias asociadas a plaquetas relevantes desde el punto de vista del diagnóstico, tal como por ejemplo el VWF, no se encuentran exclusivamente en las plaquetas, sino también en el plasma. Habitualmente, para el análisis de analitos de plaquetas intracelulares se producen lisados plaquetarios a partir de plaquetas lavadas nuevas. Para ello se suspende varias veces plasma rico en plaquetas para separar los componentes plaquetarios en una disolución de

lavado, se centrifuga y a continuación se lisan las plaquetas mediante la adición de un tampón que contiene detergente. En el lisado plaquetario libre de plasma así obtenido se determina entonces la cantidad o la actividad de un anallto deseado.

De Romeuf y Mazurler describen un procedimiento simplificado para determinar el VWF de plaquetas, en el que se 5 prescinde al menos de las etapas de lavado. El procedimiento simplificado consiste en que se centrifuga sólo una vez plasma rico en plaquetas, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en un tampón que contiene detergente. En el lisado plaquetario así obtenido se determina entonces la cantidad o la actividad el VWF de plaquetas (De Romeuf, C. y Mazurier, C. Interest of a simple and fast method for platelet von Wlllebrand factor characterlzatlon. Thrombosis Research 1996, 83(4): 287-298).

Este procedimiento simplificado tampoco es adecuado para una ejecución rutinaria en el laboratorio clínico y en particular tampoco para realizar la prueba de manera automática, dado que la preparación de las muestras todavía requiere que tenga que centrifugarse el material de muestra (plasma rico en plaquetas) y retirarse cuidadosamente el sobrenadante. Al menos en el campo de los analizadores de coagulación automáticos no se conocen sistemas que puedan centrifugar una muestra y retirar de manera precisa el sobrenadante de un sedimento celular.

Rodeghiero, F. et al. describen un procedimiento para determinar el VWF de plaquetas en lisados plaquetarios, obtenidos mediante la lisis de las plaquetas mediante la adición de detergente o glicerol (Rodeghiero, F. et al., Platelet von Willebrand factor assay: results using two methods for platelet lysls. Thrombosis Research 1990, 59: 259-267).

Thuy, L.P. et al. describen un procedimiento para determinar la actividad del receptor plaquetario para VWF bovino 20 en extractos plaquetarios humanos, obtenidos igualmente mediante la adición de detergente (Thuy, L.P. et al., Identification of platelet receptors for bovine von Willebrand factor on human platelets by a new platelet receptor test. Biochimica et Biophysica Acta 1981, 678: 187-193).

Por tanto, la presente invención se basó en el objetivo de proporcionar un procedimiento para determinar la cantidad o la actividad de un analito asociado a plaquetas en una muestra, que prescinda de una preparación de muestras 25 compleja, en particular de etapas de centrifugación y de lavado adicionales, y que sea adecuado para una ejecución rutinaria en el laboratorio clínico y en particular para su ejecución en un sistema de prueba automatizado.

El objetivo se soluciona realizando un procedimiento con las siguientes etapas:

a) proporcionar una primera mezcla básica de prueba que contiene plasma rico en plaquetas de un Individuo y un detergente,

b) proporcionar una segunda mezcla básica de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para determinar la cantidad o la actividad de un analito asociado a plaquetas en una muestra de un individuo, caracterizado porque el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) medir la cantidad o la actividad del analito en una primera mezcla básica de prueba que contiene plasma rico en 5 plaquetas del individuo y un detergente y en una segunda mezcla básica de prueba que contiene o bien

i) plasma rico en plaquetas del individuo y ningún detergente o bien

ii) plasma pobre en plaquetas del individuo y ningún detergente o bien

iii) plasma pobre en plaquetas del individuo y un detergente, y

b) comparar los resultados de medición,

correspondiendo la diferencia entre los resultados de medición a la cantidad o a la actividad del analito asociado a plaquetas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el detergente es un tensioactivo no iónico, preferiblemente del grupo de [4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil] éter de polietilenglicol (TRITON X-100), monolaurato de sorbitano- polioxietileno (20) (TWEEN 20) y polidocanol (THESIT).

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el detergente está contenido en la mezcla

básica de prueba en una concentración final con un porcentaje en volumen de desde el 0,1 hasta el 1,6%, preferiblemente en una concentración final con un porcentaje en volumen de desde el 0,2 hasta el 0,8% en la mezcla básica de prueba.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la medición de la cantidad o la actividad del 20 analito en la primera y en la segunda mezcla básica de prueba tiene lugar mezclando cada mezcla básica de prueba

con una fase sólida particulada, preferiblemente con partículas de látex, que están asociadas con al menos una pareja de unión específica de analito y en el que se mide la aglutinación de la fase sólida particulada.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores para determinar la cantidad o la actividad de un analito asociado a plaquetas del grupo de factor de von Wlllebrand, factor XIII, dímero D, fibrlnógeno y polifosfato.