Procedimiento y dispositivo de detección de la fluorescencia de un biochip.

Procedimiento de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por unos cromóforos fijados en un sustrato,

mediante iluminación de estos cromóforos a una longitud de onda de excitación y captación de la luz emitida por los cromóforos en respuesta a esta iluminación, siendo el sustrato (12) por lo menos parcialmente transparente a la longitud de onda de emisión de los cromóforos, y portando unas sondas biológicas (14) destinadas a ser puestas en contacto con unas dianas biológicas estudiadas, que comprende las etapas siguientes:

- colocar o fijar en el sustrato (12) un dispositivo fluídico (22) que comprende unos canales y/o unas cámaras (28, 30, 32) de introducción o de circulación de fluidos,

- poner el sustrato (12) que porta el dispositivo fluídico (22) en contacto con un sensor (10), por ejemplo con matriz de fotodetectores del tipo CCD o CMOS o con emulsión fotosensible, interponiendo entre los cromóforos y el sensor (10) un filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación, siendo este filtro transparente a la longitud de onda de emisión,

- utilizar el dispositivo fluídico (22) para poner unas dianas biológicas en contacto con las sondas (14) fijadas en el sustrato (12),

- e iluminar después el sustrato a la longitud de onda de excitación de los cromóforos y detectar por medio del sensor las señales luminosas emitidas por los cromóforos.

Procedimiento y dispositivo de detección de la fluorescencia de un biochip.

La invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo de detección de la fluorescencia de un biochip, y más precisamente de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por cromóforos fijados en un sustrato del biochip.

Los biochips se utilizan ampliamente en la actualidad tanto para la investigación como en la industria. Comprenden esencialmente un sustrato sólido, en general plano, sobre el que se inmovilizan biomoléculas tales como cadenas de ADN o de ARN, proteínas, antígenos, anticuerpos, aptámeros, etc. o bien microorganismos enteros o fraccionados tales como bacterias, células, virus, esporas, etc., o incluso microobjetos que portan a su vez biomoléculas.

Los biochips de fluorescencia conocidos están constituidos por lo general por una hoja de vidrio cuya superficie se ha funcionalizado químicamente y porta, tras reaccionar con componentes de interés, "puntos" fluorescentes que, en respuesta a una excitación luminosa de una longitud de onda dada, emiten una luz a otra longitud de onda.

Esta luz emitida puede ser captada por un sistema óptico apropiado y ser transmitida a un sensor, por ejemplo a fotodetectores del tipo CCD o CMOS. La imagen obtenida de la superficie del biochip comprende unos puntos luminosos cuyas intensidades dependen de la cantidad de cromóforos presentes en estos puntos. Para un buen análisis de los "puntos", es necesario disponer de una imagen de estos puntos que presente suficiente fidelidad y resolución.

Los cromóforos dispuestos en la superficie de contacto entre un medio de índice superior y un medio de índice inferior (normalmente una superficie de contacto vidrio-aire o vidrio-líquido) emitirán preferentemente hacia el medio de índice superior a una razón igual (en una primera aproximación) al cubo de la razón de los índices de refracción de los dos medios, es decir, aproximadamente 4, 1 en el caso del vidrio y el aire, lo cual significa que, cuando el sensor está colocado por encima del biochip, aproximadamente el 80% de la emisión luminosa de los cromóforos se pierde en la hoja de vidrio.

Además, los sistemas ópticos utilizados presentan una apertura digital limitada de modo que sólo una pequeña fracción de la luz emitida hacia el aire puede ser transmitida al sensor. La eficacia total de captación de la luz emitida por los cromóforos está por tanto limitada a ciertos porcentajes.

Para disminuir estos inconvenientes ya se ha propuesto captar la luz emitida por los cromóforos hacia el medio de índice superior. En este contexto, la forma de realización más simple consiste en utilizar el sensor en sí mismo como sustrato del biochip y, por tanto, en depositar sobre la superficie del sensor una red de sondas biológicas que se pondrá a continuación en contacto con las moléculas que se van a analizar.

El inconveniente de esta técnica es su coste, ya que cada análisis requiere el empleo de un nuevo sensor.

El documento US nº 6.479.301 B1 (véanse las figuras 1, 9-10A) da a conocer un dispositivo (un lector de microplacas) de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por cromóforos fijados en un sustrato (microplaca 1A, 20) que comprende un sustrato (microplaca 1A) que es transparente a la emisión de los cromóforos en dirección descendente tras una excitación óptica de un haz de luz procedente de una fuente situada por encima del sustrato. Un filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación de los cromóforos está constituido o bien por la puerta de transferencia de CCD, la placa frontal de fibras ópticas, una capa o red de aluminio 17, o bien por una capa dieléctrica 18 interpuesta entre la microplaca (1A, 20) y una cámara (10) CCD. La microplaca (1A, 20) se pone en contacto óptico con la cámara (10) CCD por medio de una placa frontal de fibras ópticas para la formación de una imagen de los cromóforos en la cámara (10) CCD de una manera que permite separar el sustrato del sensor tras la utilización.

La presente invención tiene esencialmente como objetivo aportar una solución sencilla, económica y eficaz para el conjunto de estos problemas.

La presente solicitud se refiere a un procedimiento de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por cromóforos fijados en un sustrato de un biochip, consistiendo la detección en iluminar los cromóforos con una longitud de onda de excitación y en captar la luz emitida por los cromóforos en respuesta a esta iluminación. El procedimiento consiste en utilizar un sustrato por lo menos parcialmente transparente a la longitud de onda de emisión de los cromóforos y que porta unas sondas biológicas puestas en contacto con unas dianas biológicas estudiadas, en poner el sustrato en contacto óptico con un sensor, por ejemplo con matriz de fotodetectores del tipo CCD o CMOS o con emulsión fotosensible, interponiendo entre los cromóforos y el sensor un filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación, siendo este filtro transparente a la longitud de onda de emisión, y garantizando eventualmente una continuidad de índice por lo menos parcial entre el sustrato y el sensor, y después en iluminar el sustrato a la longitud de onda de excitación de los cromóforos y en detectar por medio del sensor las señales luminosas emitidas por los cromóforos.

Tras la adquisición de estas señales luminosas, se puede volver a utilizar el sensor para otro análisis: basta con separar el sustrato del sensor y sustituirlo por otro sustrato.

La adquisición de las señales luminosas de los cromóforos se puede realizar "en seco" de manera tradicional, secándose el sustrato antes de ser colocado sobre el sensor.

También se pueden interponer un conjunto de fibras ópticas, que se presentan en forma de un bloque o de una torta plana, entre el sustrato y el sensor o entre el sustrato y el filtro.

El procedimiento según la invención prevé colocar y fijar en el sustrato un dispositivo fluídico que comprende unos canales y/o unas cámaras de introducción o de circulación de fluidos, y utilizar este dispositivo para poner unas dianas biológicas en contacto con las sondas fijadas en el sustrato.

En este caso, se puede colocar el conjunto formado por el dispositivo fluídico y por el sustrato sobre el sensor antes de que las dianas biológicas se pongan en contacto con las sondas del sustrato.

La adquisición de las imágenes por medio del sensor permite entonces seguir en tiempo real las interacciones entre las dianas y las sondas, por ejemplo mediante análisis de la forma y de la intensidad de los puntos.

La presente solicitud también se refiere a un dispositivo de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por cromóforos fijados en un sustrato de un biochip, realizándose la formación de imágenes y la detección mediante la realización del procedimiento descrito anteriormente. El dispositivo comprende:

- un sustrato por lo menos parcialmente transparente a la longitud de onda de emisión de los cromóforos, -un filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación de los cromóforos, -unos medios de detección y de adquisición de la luz emitida por los cromóforos en respuesta a su excitación luminosa, comprendiendo estos medios un sensor con matriz de fotodetectores del tipo CCD o CMOS, por ejemplo, o con emulsión fotosensible, y -unos medios de puesta en contacto óptico del sustrato con el sensor, para la formación de una imagen de los cromóforos sobre el sensor y que permiten retirar el sustrato del sensor tras la utilización.

El sustrato comprende por ejemplo una placa delgada de vidrio o de zafiro, una película de un material de plástico tal como PDMS, Mylar, Zeonex, un filtro polarizador, un haz de fibras ópticas o un conjunto de tubos capilares que contienen las sondas.

Como variante, el sustrato puede estar formado por el filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación.

Ventajosamente, este filtro comprende un filtro absorbente o un filtro reflectante o una combinación de filtros absorbente y reflectante, en particular tal como se describe en la solicitud anterior WO 200704575 del solicitante.

Pueden estar previstos unos medios para garantizar una continuidad de índice entre el sustrato y el sensor y comprenden una capa delgada de líquido o de gel de índice apropiado o de material flexible (por ejemplo de PDMS) que une el sustrato al sensor.

Según la invención, un dispositivo fluídico que comprende unos canales y/o unas cámaras de introducción o de circulación de fluidos está destinado a ser colocado sobre el sustrato para poner... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por unos cromóforos fijados en un sustrato, mediante iluminación de estos cromóforos a una longitud de onda de excitación y captación de la luz emitida por los cromóforos en respuesta a esta iluminación, siendo el sustrato (12) por lo menos parcialmente transparente a la longitud de onda de emisión de los cromóforos, y portando unas sondas biológicas (14) destinadas a ser puestas en contacto con unas dianas biológicas estudiadas, que comprende las etapas siguientes:

- colocar o fijar en el sustrato (12) un dispositivo fluídico (22) que comprende unos canales y/o unas cámaras (28, 30, 32) de introducción o de circulación de fluidos, -poner el sustrato (12) que porta el dispositivo fluídico (22) en contacto con un sensor (10) , por ejemplo con matriz de fotodetectores del tipo CCD o CMOS o con emulsión fotosensible, interponiendo entre los cromóforos y el sensor (10) un filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación, siendo este filtro transparente a la longitud de onda de emisión, -utilizar el dispositivo fluídico (22) para poner unas dianas biológicas en contacto con las sondas (14) fijadas en el sustrato (12) , -e iluminar después el sustrato a la longitud de onda de excitación de los cromóforos y detectar por medio del sensor las señales luminosas emitidas por los cromóforos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que se garantiza una continuidad de índice por lo menos parcial entre el sustrato (12) y el sensor (10) .

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que se transmite una imagen de las sondas (14) al sensor por medio de un bloque o de una torta (16) de fibras ópticas.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que, tras la adquisición de las señales luminosas emitidas por los cromóforos, el sensor (10) se separa del sustrato (12) y se puede volver a utilizar con otro sustrato.

5. Dispositivo de formación de imágenes y de detección de la fluorescencia emitida por unos cromóforos fijados en un sustrato, mediante la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, que comprende un sustrato (12) por lo menos parcialmente transparente a la longitud de onda de emisión de los cromóforos y medios de formación de imágenes, de detección y de adquisición de la luz emitida por los cromóforos en respuesta a su excitación luminosa, comprendiendo estos medios un sensor (10) del tipo con matriz de fotodetectores CCD o CMOS por ejemplo

o con emulsión fotosensible, que comprende además:

- un dispositivo fluídico (22) que comprende unos canales y/o unas cámaras (28, 30, 32) de introducción o de circulación de fluido, colocado o fijado en el sustrato (12) para poner unas dianas biológicas en contacto con las sondas (14) fijadas en el sustrato y colocado con el sustrato sobre el sensor (10) , -un filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación de los cromóforos, dispuesto entre los cromóforos y el sensor (10) , -y unos medios de puesta en contacto óptico del sustrato (12) con el sensor (10) , para la formación de una imagen de los cromóforos sobre el sensor y que permite separar el sustrato del sensor tras la utilización.

6. Dispositivo según la reivindicación 5, caracterizado por que el sustrato comprende una placa delgada de vidrio o de zafiro, una película de una material de plástico tal como PDMS, Mylar, Zeonex, un filtro polarizador, un conjunto de fibras ópticas o un conjunto de tubos capilares que contienen las sondas.

7. Dispositivo según la reivindicación 5, caracterizado por que el sustrato está formado por el filtro de eliminación de la longitud de onda de excitación.

8. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que el filtro de eliminación comprende un filtro absorbente o un filtro reflectante o una combinación de filtros absorbente y reflectante.

9. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por que comprende unos medios que garantizan una continuidad de índice entre el sustrato y el sensor, que comprenden una capa delgada de líquido o de gel o de material flexible de índice apropiado que une el sustrato al sensor.

10. Dispositivo según una de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado por que el dispositivo fluídico (22) está realizado en vidrio mediante grabado o en polímero por moldeo, termoconformación o ensamblaje de películas de polímero que comprenden unos recortes correspondientes a los canales y/o a las cámaras mencionados anteriormente.