Derivados de oligotiofeno como sondas moleculares.

Un derivado de oligotiofeno según la fórmula (I)**Fórmula**

en donde

R3 puede elegirse entre**Fórmula** ó **Fórmula**

y donde

n puede variar entre 0 y 3,

Y- es el contraión aniónico y puede ser, aunque sin limitación, bromo, cloro, yodo o 4-metilbencenosulfonato, X se puede elegir entre O (n ≥ 1) ó CH2 (n ≥ 0-3), y

cada uno de R1 y R2 se selecciona de forma independiente del grupo que consiste en 5-clorotiofen-2-ilo (1), 5- bromotiofen-2-ilo (2), 5-iodotiofen-2-ilo (3),5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5- formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo con isótopos enriquecidos de 18F ó 19F (10), 5-tiofen-2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo enriquecido isotópicamente con carbono 11C (12) según las fórmulas**Fórmulas**

Derivados de oligotiofeno como sondas moleculares Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos derivados de oligotiofeno y a su uso como sondas moleculares. En particular, se contempla el uso de los derivados de oligotiofeno como sondas moleculares para detectar, Identificar, separar y aislar células madre neuronales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las afecciones neurológicas afectan a un segmento grande de la población humana. Con la expectativa de que el porcentaje de gente que alcance la tercera edad en las próximas décadas aumente, también es de esperar, sin duda, que el porcentaje de gente afligida por una afección neurológica se incremente.

Una de las afecciones neurológicas más prevalentes es la apoplejía, causa principal de dlscapacldad en todo el mundo. Más allá de las terapias de rehabilitación tras una apoplejía, una vez que la recuperación tras una apoplejía ha alcanzado un nivel estacionario y los déficits neurológlcos han quedado fijos, no existen tratamientos aceptados para mejorar dichos déficits neurológicos.

Las células madre, tal como las células madre neuronales, normalmente son Identificadas, caracterizadas y separadas de otras células mediante técnicas inmunohlstológlcas, tal como mediante anticuerpos, dirigidos a distintas dianas blomoleculares. Sin embargo, dichas técnicas están cargadas de limitaciones - la mayoría de los marcadores actuales no son suficientemente específicos y selectivos para detectar e identificar células madre neuronales en un sistema biológico complejo. Adicionalmente, la mayoría de los marcadores existentes requieren métodos de detección secundarios, lo cual requiere mucho tiempo. También es posible marcar células seleccionadas genéticamente, por ejemplo, con una proteína fluorescente tal como GFP, pero dicho mareaje requiere de técnicas genéticas o invasivas y por tanto una modulación y casi con total seguridad una selección de las células.

Por consiguiente, las células específicas, p.ej. las células madre neuronales, son identificadas con diversos marcadores. Normalmente, se usa un conjunto de marcadores adecuados detectables por anticuerpos específicos, donde algunos son más selectivos que otros para el tipo de célula específico analizado. Sin embargo, es el uso combinado de varios marcadores el que detecta e identifica el tipo celular, p.ej., las células madre neuronales. Por tanto, cada tipo de célula, tal como una célula madre neuronal, tiene una determinada combinación de marcadores sobre su superficie que la hace distinguible de otros tipos de células.

Sin embargo, el uso de un conjunto de marcadores menos específicos para detectar e identificar tipos celulares tales como las células madre neuronales, es un procedimiento lento e ineficiente, y también poco preciso. También es difícil usar un conjunto de anticuerpos para la selección específica y el aislamiento de células neuronales, o, alternativamente, el uso de un método de purificación basado en varias etapas secuenciales de aislamiento usando un marcador en cada etapa. Éste último puede prolongar aún más el proceso de aislamiento generando una pérdida de viabilidad y calidad de las células aisladas.

Por lo tanto, es necesario el desarrollo de moléculas para la identificación selectiva y específica de moléculas diana sencillas altamente específicas de células madre neuronales.

Las moléculas en las que dos o más anillos de tiofeno están unidos se denominan oligotiofenos. Dichos compuestos poseen propiedades ópticas y electrónicas interesantes. Como ejemplos, están la fluorescencia, la semlconductancla y la emisión de luz, si se estimulan correctamente. Una de las propiedades más destacadas de los oligotiofenos es su fluorescencia. Cambiando su estructura es posible obtener emisiones en el espectro visible

completo.

Áslund et al han publicado una nueva clase de derivados de oligotiofeno definidos químicamente para la detección de agregados de proteína patógenas (Áslund et al., ACS Chem. Biol. 29, 4, 673-684).

Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar marcadores más selectivos y específicos para células madre, particularmente células madre neuronales, para detectar e Identificar dichas células, y para permitir un aislamiento selectivo y específico de dichas células usando una única molécula diana en lugar de un conjunto para mejorar la viabilidad y la calidad de las células aisladas. Por consiguiente, la presente Invención busca proporcionar los medios y los métodos que permitan dicha detección, identificación y aislamiento selectivos y específicos de células madre neuronales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la presente invención proporciona un derivado de oligotiofeno según la fórmula (I)

R3 R3

y/

II s'

(I)

donde

R3 puede elegirse entre

y donde

n varía entre y 3,

Y' es el contraión aniónico y puede ser, aunque sin limitación, bromo, cloro, yodo, 4-metilbencenosulfonato o 1 cualquier otro anión fisiológicamente posible,

X se puede seleccionar entre O (n > 1, tal como 1,2,3, etc.) ó CH2 (n = -3), y

cada uno de R1 y R2 se selecciona de forma independiente entre 5-clorotiofen-2-ilo (1), 5-bromotiofen-2-ilo (2), 5- iodotiofen-2-ilo (3), 5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5-formiltiofen-2-ilo (7), 5- acetiltiofen-2-ilo (8), 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9). Adicionalmente, el 5-fluorotiofen-2-ilo (1) puede presentar 15 isótopos enriquecidos de 18F o 19F. Para 5, el protón de la posición 5 puede ser sustituido por un tritio (11) y para 4 el grupo metilo puede constar de un carbono enriquecido isotópicamente tal como 11C (12) (mostrado en la presente memoria a continuación)

1 2 3

o

8 9 1

11 12

En otra realización, R1 puede ser

donde

n varía entre y 3

Y' es, como en la anterior fórmula (i), el contraión aniónico y puede ser, aunque sin limitación, bromo, cloro, yodo o 4-metilbencenosulfonato,

X se puede elegir entre O (n > 1) ó CH2 (n > ), y

R4 se selecciona entre bromo, cloro, hidrógeno, yodo, metilo, 5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5-formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5- fluorotiofen-2-ilo (1) con isótopos enriquecidos en 18F ó 19F. Comenzando con el 5, el protón de la posición 5 puede ser sustituido por un tritio (11) y para 4 el grupo metilo puede constar de un carbono enriquecido isotópicamente tal 1 como 11C (12).

Existen otras realizaciones en las que si R1 es acorde a la fórmula (iii) entonces R2 puede seleccionarse entre bromo, cloro, hidrógeno, yodo, metilo, 5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5- formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo (1) con 15 isótopos enriquecidos en 18F ó 19F (1), 5-tiofen-2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo enriquecido isotópicamente

con 11C (12):

Ht>V

4 5 6 7

O

H3C XJ

8 9 1

^Vv y

ií 12

Existen otras realizaciones en las que R3 es acorde a la fórmula (i), y donde n es 1, X es CH2, Y' es 4- metilbencenosulfonato, y R1 y R2 es 5 según la fórmula

Existen otras realizaciones en las que R3 es acorde a la fórmula (i), y donde n es 1, X es CH2, Y' es 4- metilbencenosulfonato, R1 es iii y R2 es hidrógeno según la fórmula

Existen otras realizaciones en las que los derivados de oligotiofeno según la invención son luminiscentes.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una composición para detectar células madre neuronales y células madre de cáncer neuronal que comprende cualquiera de los derivados de oligotiofeno según la invención.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para detectar células madre neuronales en una muestra biológica in vitro, método que comprende las etapas de

a. poner en contacto dicha muestra con un derivado de oligotiofeno según la invención o una composición que comprende al menos un derivado de oligotiofeno según la invención o... [Seguir leyendo]

1. Un derivado de oligotiofeno según la fórmula (I)

R3 puede elegirse entre

^ JUW

(O (#)

y donde

n puede variar entre y 3,

Y- es el contraión aniónico y puede ser, aunque sin limitación, bromo, cloro, yodo o 4-metilbencenosulfonato,

X se puede elegir entre O (n > 1) ó CH2 (n = -3), y

cada uno de R1 y R2 se selecciona de forma independiente del grupo que consiste en 5-clorotiofen-2-ilo (1), 5- bromotiofen-2-ilo (2), 5-iodotiofen-2-ilo (3),5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5- formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo con isótopos enriquecidos de 18F ó 19F (1), 5-tiofen-2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo enriquecido isotópicamente con 15 carbono 11C (12) según las fórmulas

2. Un derivado de oligotiofeno según la fórmula 1

donde R1 es

y donde

n puede variar entre y 3,

Y- es el contraión aniónico y puede ser, aunque sin limitación, bromo, cloro, yodo o 4-metilbencenosulfonato,

X se puede elegir entre O (n >1) ó CH2 (n > ),

R2 se selecciona del grupo que consiste en 5-clorotiofen-2-ilo (1), 5-bromotiofen-2-ilo (2), 5-iodotiofen-2-ilo (3), 51 metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5-formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo con isótopos enriquecidos de 18F ó 19F (1), 5-tiofen-2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo enriquecido isotópicamente con carbono 11C (12) según las fórmulas

R4 se selecciona del grupo que consiste en bromo, cloro, hidrógeno, yodo, metilo, 5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5-form¡ltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo con isótopos enriquecidos de 18F ó 19F (1), 5-tiofen-2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo enriquecido isotópicamente con carbono 11C (12) según las fórmulas:

3. Un derivado de oligotiofeno según la fórmula (I),

(I)

r2

donde R1 es

R3 se elige entre

y donde

n puede variar entre y 3,

Y' es el contraión aniónico y puede ser, aunque sin limitación, bromo, cloro, yodo o 4-metilbencenosulfonato, 15 X se puede elegir entre O (n > 1) ó CH2 (n = -3),

y donde R2 y R4 se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en bromo, cloro, hidrógeno, yodo, metilo, 5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5-formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2- ilo (8) y 2-¡l-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo con isótopos enriquecidos de 18F ó 19F (1), 5-tiofen- 2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo enriquecido isotópicamente con carbono 11C (12) según las fórmulas:

O

8 9 1

4. El derivado de oligotiofeno según la reivindicación 1, en donde

R3 es según la fórmula (i), y donde 1 n es 1,

X es CH2,

Y' es 4-metilbenzenosulfonato,

R1 y R2 son según la fórmula 5 de la reivindicación 1, lo que proporciona la fórmula

5. Un derivado de oligotiofeno según la fórmula (I),

(I)

donde R1 es

y donde R3 es,

\

H2nCns

X

I

(

y donde n es 1,

X es CH2,

Y" es 4-metilbenzenosulfonato,

R4 se selecciona del grupo que consiste en bromo, cloro, hidrógeno, yodo, metilo, 5-metiltiofen-2-ilo (4), tiofen-2-ilo (5), 5-ácido tiofencarboxílico-2-ilo (6), 5-formiltiofen-2-ilo (7), 5-acetiltiofen-2-ilo (8) y 2-il-tiofen-5-carboxilato de metilo (9), 5-fluorotiofen-2-ilo con isótopos enriquecidos de 18F ó 19F (1), 5-tiofen-2-ilo con tritio (11) y 5-metiltiofen-2-ilo 1 enriquecido isotópicamente con carbono 11C (12) según las fórmulas:

y R2 es hidrógeno,

lo que proporciona la fórmula

6. El derivado de oligotiofeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es luminiscente.

7. El derivado de oligotiofeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que está conjugado a un resto detectable, donde el resto detectable es un radioisótopo, un radionucleido, una marca fluorescente, una marca enzimática, una marca quimioluminiscente, un grupo de biotinilo y un epítopo de polipéptido predeterminado reconocido por una entidad de unión secundaria; p.ej. secuencias de par de cremallera de leucina; un sitio de unión

para un anticuerpo secundario, un dominio de unión de metal, un epítopo, una etiqueta de proteína, o un carbohidrato.

8. Una composición para uso en la detección de células madre neuronales que comprende el derivado de oligotiofeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un tampón.

9. Un método para detectar células madre neuronales o células madre de cáncer neuronal en una muestra biológica in vitro, método que comprende las etapas de

a. poner en contacto dicha muestra con una composición que comprende al menos un derivado de ollgotlofeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición según la reivindicación 8, durante un tiempo suficiente para formar al menos un complejo de célula madre neuronal - derivado de oligotiofeno o para formar al menos un complejo de célula madre de cáncer neuronal - derivado de oligotiofeno,

b. detectar dichos complejos de célula madre neuronal - derivado de oligotiofeno o dichos complejos de célula madre de cáncer neuronal - derivado de oligotiofeno,

1. El método según la reivindicación 9, donde el control positivo comprende células madre neuronales o células madre de cáncer neuronal.

11. Un método para separar células madre neuronales o células madre de cáncer neuronal de otros materiales biológicos en una muestra biológica in vitro, método que comprende las etapas de

a. poner en contacto dicha muestra con una composición que comprende al menos un derivado de oligotiofeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición según la reivindicación 8, durante un tiempo suficiente para formar al menos un complejo de célula madre neuronal - derivado de oligotiofeno o para formar al menos un complejo de célula madre de cáncer neuronal - derivado de oligotiofeno,

b. detectar dichos complejos de célula madre neuronal - derivado de oligotiofeno o de célula madre de cáncer neuronal - derivado de oligotiofeno,

c. separar dichos complejos detectados de célula madre neuronal - derivado de oligotiofeno o dichos complejos detectados de célula madre de cáncer neuronal - derivado de oligotiofeno, separando de este modo las células madre neuronales o las células madre de cáncer neuronal.

12. El método de la reivindicación 11, que además comprende la etapa de aislar dichas células madre neuronales o dichas células madre de cáncer neuronal.

13. El uso del derivado de oligotiofeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o de la composición según la reivindicación 8, para detectar células madre neuronales o células madre de cáncer neuronal in vitro.

14. El uso del derivado de oligotiofeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o de la composición según la reivindicación 8, para separar células madre neuronales o células madre de cáncer neuronal in vitro.

15. Un kit que comprende

a. el derivado de oligotiofeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o de la composición según la reivindicación 8 y

b. opcionalmente, instrucciones para usar el derivado de oligotiofeno o la composición.