Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol.

Un compuesto seleccionado de la Fórmula I:**Fórmula**

en la que:

L es:**Fórmula**

E es**Fórmula**

n es 2, 3, 4, 5 o 6;

m es 2, 3 o 4; y

q es 0 o 1.

Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de conformidad con la solicitud provisional de EE.UU. N- de serie 61/414.535, presentada el 17 de noviembre de 2010.

Campo de ia invención

La invención se refiere, en general, a anticuerpos conjugados con restos de fármaco maitansinoide para formar conjugados de anticuerpo-fármaco con aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Los anticuerpos se pueden modificar genéticamente con aminoácidos de cisterna libres, reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores de los fármacos alaninil-maitansinoides. La invención también se refiere a métodos de uso de los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco alaninil-maitansinoide para el diagnóstico o el tratamiento /n v/'fro, /n s/'fu e /n v/'vo de células de mamífero o afecciones patológicas asociadas.

Antecedentes de ¡a invención

Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son moléculas quimioterapéuticas dirigidas que combinan las propiedades ideales tanto de los anticuerpos como de los fármacos citotóxicos mediante la dirección de potentes fármacos citotóxicos a las células tumorales que expresan el antígeno, la interiorización y la liberación del fármaco, aumentando así su actividad antitumoral. El desarrollo exitoso de ADC para un antígeno diana dado depende de la optimización de la selección de los anticuerpos, del diseño y de la estabilidad de los enlazadores, de la potencia del fármaco cltotóxlco, y del modo de conjugación entre el fármaco y el enlazador al anticuerpo. Las propiedades de pH de los enlazadores, así como las sensibilidades rédox y la susceptibilidad a las proteasas, influyen en la Interiorización y la liberación del resto de fármaco citotóxico. La escisión ¡ntracelular de los enlazadores que contienen disulfuro de un ADC está limitada por el potencial de oxidación de los endosomas y los lisosomas, y probablemente no sean liberados por la escisión reductora dentro de la vía endocítlca (Austin et al. (2005) Proc. /Vaf/. Acad. Se/. EE.UU. 102(50): 17987-17992). La escisión reductora se puede producir en la membrana celular y conferir un efecto destructor espectador de las células tumorales y normales susceptibles mediante el fármaco libre. Es probable que la liberación Inapropiada del fármaco contribuya a la toxicidad. Una vez interiorizado, la eficacia del ADC depende de la digestión proteolítlca de la actividad del fármaco. La estabilidad del enlazador desempeña un papel Importante tanto en la eficacia como en la toxicidad del ADC (Alley et al., (2008) S/ocon/'ugafe C/?em. 19: 759- 765). Los enlazadores estables tales como mee son más eficaces y más seguros que los enlazadores de disulfuro, Inestables, ampliando la ventana terapéutica.

Es posible modificar anticuerpos con sustituciones de clsteína (ThioMab y ThioFab) en sitios donde las cisternas se encuentran disponibles para la conjugación, pero no perturban el plegamiento ni el ensamblaje de las inmunoglobulinas, ni alteran la unión al antígeno ni las funciones efectoras (Junutula, et al., 2008b /Vafure B/'ofecb., 26(8): 925-932; Doman et al. (2009) "Blood" 114(13):2721-2729, US 7521541, US 7723485; W02009/052249). Estos ThioMab se pueden conjugar luego con fármacos citotóxicos a través de los grupos tiol de las cisternas modificados genéticamente para obtener conjugados de ThioMab-fármaco (TDC) con estequiometría uniforme (aproximadamente 2 fármacos por anticuerpo). Los estudios con múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos han mostrado que los TDC son tan eficaces como los ADC convencionales en modelos de xenoinjerto y que se toleran a dosis más elevadas en los modelos preclínicos pertinentes. Los conjugados de ThioMab-fármaco se han modificado genéticamente mediante la unión del fármaco a diferentes partes del anticuerpo (Fab de cadena ligera, Fab de cadena pesada y Fe de cadena pesada). La estabilidad /n v/fro e /n v/vo, la eficacia y las propiedades farmacoclnétlcas de los TDC proporcionan una ventaja única frente a los ADC convencionales debido a su homogeneidad y a la conjugación específica del sitio con los fármacos citotóxicos.

Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) compuestos del maitansinoide DM1 enlazado a trastuzumab muestran una potente actividad antitumoral en las líneas de células tumorales sensibles y resistentes a trastuzumab con sobreexpresión de HER2 y en modelos de xenoinjerto de cáncer humano. Trastuzumab-mcc-DM1 (T-DM1) se encuentra actualmente en evaluación en ensayos clínicos de fase II en pacientes cuya enfermedad es refractaria a los tratamientos dirigidos a FIER2 (Beeram et al. (2007) "A phase I study of trastuzumab-mcc-DM1 (T-DM1), a first- in-class FIER2 antibody-drug conjúgate (ADC), in patients (pts) with FIER2+ metastatic breast cáncer (BC)", American Society of Clinical Oncology 43rd: 2 de junio (Sumario 1042; Krop et al., European Cáncer Conference ECCO, Póster 2118, 23-27 de septiembre de 2007, Barcelona; US 7097840; US 2005/0276812; US 2005/0166993).

Los maitansinoides, derivados del fármaco antimitótico maitansina, se unen a los microtúbulos de una manera similar a los fármacos alcaloides de la vinca (Issell B. F. et al. (1978) Cáncer Treaf. f?ev. 5:199-207; Cabanillas F. et al. (1979) Cáncer Treaf f?ep, 63:507-9. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) compuestos del maitansinoide DM1 enlazado a trastuzumab muestran una potente actividad antitumoral en las líneas de células tumorales sensibles y resistentes a trastuzumab con sobreexpresión de HER2 y modelos de xenoinjertos de cáncer de mama

humano. Un conjugado de maitansinoides enlazados al anticuerpo de cáncer de mama murino anti-HER2 TA.1 a través del enlazador mee fue 200 veces menos potente que el conjugado correspondiente con un enlazador de disulfuro (Chari et al. (1992) Cáncer Res. 127-133). Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) compuestos del maitansinoide DM1 enlazado a trastuzumab muestran una potente actividad antitumoral en las líneas de células tumorales sensibles y resistentes a trastuzumab con sobreexpresión de HER2 y modelos de xenoinjertos de cáncer humano.

Trastuzumab-mcc-DM1 (trastuzumab emtansina, trastuzumab-DM1; T-DM1; PR0132365), un nuevo conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) diseñado específicamente para el tratamiento del cáncer de mama positivo en HER2, se compone del agente citotóxico DM1 (un agente anti-microtúbulos maitansinoide que contiene tiol) conjugado con trastuzumab (US 6407213) a través de cadenas laterales de lisina, con una proporción media de fármaco con respecto a anticuerpo de aproximadamente 3,4:1. T-DM1 está en desarrollo para el tratamiento del cáncer de mama metastásico HER2+ (Beeram M., Burris H., Modi S. et al. (2008) J C//n Onco/26: 20 de mayo supl; sumario 1028). T- DM1 se une a HER2 con una afinidad similar a la de trastuzumab. Dicha unión se requiere para la actividad antitumoral de T-DM1 (Folleto para investigadores de HERCEPTIN^, Genentech, Ine., South San Francisco, CA, julio de 2007). Se plantea la hipótesis de que, tras la unión a HER2, T-DM1 sufre la interiorización mediada por el receptor, lo que produce la liberación intracelular de DM1 y la posterior muerte celular (Austin C. D., De Maziére A. M., Pisacane P. I., et al. (2004) Mo/Ce//S/o/15 (12): 5268-5282).

Se ensayó el ADC de trastuzumab-maitansinoide con diversos enlazadores para determinar la eficacia /n v/fro e /n v/vo, la farmacocinética y la toxicidad en estudios preclínicos (Phillips et al. (2008) Cáncer Res. 68 (22): 9280-9290). Trastuzumab enlazado a DM1 a través de un enlace de tioéter no reducible (mee) mostró una actividad superior en comparación con trastuzumab no conjugado o trastuzumab enlazado a otros maitansinoides a través de enlazadores de disulfuro. Dado que trastuzumab enlazado a DM1 a través de un enlazador no reducible ofrece una eficacia y una farmacocinética mejores, así como una toxicidad reducida frente a los enlazadores de disulfuro reducibles evaluados, se seleccionó trastuzumab-mcc-DM1 para el desarrollo clínico.

DM1 es un maitansinoide que contiene tiol derivado del éster de origen natural ansamitocina P3 (Remillard S., Rebhun L. I., Howie G. A., et al. (1975) Science 189(4207): 1002-1005.3; Cassady J. M., Chan K. K., Floss H. G. (2004) Chem Pharm Bu// 52(1 ):1-26.4). El éster vegetal relacionado, la maitansina, se ha estudiado como agente quimioterapéutico en aproximadamente 800 pacientes, administrado a una dosis de 2,0 mg/rn^ cada 3 semanas, bien como una sola dosis o durante 3 días consecutivos (Issell B. F., Crooke S. T. (1978) "Maytansine". Cáncer 7reaf Rev 5:199-207). A pesar de la actividad no clínica, la actividad clínica de la maitansina fue modesta a las dosis que se... [Seguir leyendo]

n es 2, 3, 4, 5 o 6; m es 2, 3 o 4; y q es 0 o 1.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que L es

-(CH2)n-.

3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que n es 5.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que L es:

O

(Ch<2)nCNHtCHpCHpO^CHzCHz

5. El compuesto de la reivindicación 4, en el que n es 4 y m es 3.

6. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la estructura:

o

o

7. Un conjugado de anticuerpo-fármaco seleccionado de las Fórmulas la o Ib:

en las que: L es

n es 2, 3, 4, 5 o 6; m es 2, 3 o 4; q es 0 o 1; p es 1 a 4; y Ab es un anticuerpo.

8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 7 seleccionado de las estructuras:

9. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8 en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado genéticamente con cisterna (Ab) conjugado a través de un aminoácido de cisterna libre a un enlazador (L).

10. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 9, en el que:

el aminoácido de cisterna libre del anticuerpo modificado genéticamente con cisterna es A118C (numeración de UE) de la cadena pesada; o el aminoácido de cisterna libre del anticuerpo modificado genéticamente con cisterna es V205C (numeración de Kabat) de la cadena ligera; o el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna comprende un aminoácido de cisterna libre y una secuencia de la cadena pesada seleccionada entre las SEC ID N-1-49 o una secuencia de la cadena ligera seleccionada entre las SEC ID N- 50-98, en las que una cisterna de la secuencia es el aminoácido de cisterna libre.

11. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna se prepara mediante un proceso que comprende:

(i) someter a mutagénesis una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna;

(¡i) expresar el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna; y (iii) aislar y purificar el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna.

12. El conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna se selecciona entre un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento Fab.

13. El conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el anticuerpo modificado genéticamente con cisterna se prepara mediante un proceso que comprende reemplazar uno o más restos de aminoácido de un anticuerpo parental por uno o más aminoácidos de cisteína libres, donde el anticuerpo parental se une selectivamente a un antígeno y el anticuerpo modificado genéticamente con cisteína se une selectivamente al mismo antígeno que el anticuerpo parental.

14. El conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que el anticuerpo se une a uno o más receptores (1 )-(51):

(1) BMPR1B (receptor de proteína morfogenétlca ósea de tipo IB);

(2) E16 (LAT1, SLC7A5);

(3) STEAP1 (seis antígenos epiteliales transmembrana de próstata);

(4) 0772P (CA125, MUC16);

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina);

(6) Nap¡3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de portadores de soluto 34 (tostato sódico), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente del sodio de tipo II);

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmàtico corto, (semaforina) 5B);

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN ADNc 2700050C12, gen RIKEN ADNc 2700050C12);

(9) ETBR (receptor de endotelina de tipo B);

(10) MSG783 (RNF124, proteina hipotética FLJ20315);

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMPI, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteina 1 asociada al cáncer de próstata, seis antígenos epiteliales transmembrana de próstata 2, seis proteínas de próstata transmembrana);

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico de potencial receptor transitorio, subfamilia

M, miembro 4);

(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);

(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein Barr) o Hs.73792);

(15) CD79b (CD79B, CD79)3, IGb ()3 asociado a inmunoglobulina), B29);

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteina 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);

(17) HER2;

(18) NCA;

(19) MDP;

(20) IL20Rct;

(21) Brevican;

(22) EphB2R;

(23) ASLG659;

(24) PSCA;

(25) GEDA;

(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de llnfocltos B, receptor BLyS 3, BR3);

(27) CD22 (¡soforma CD22-B del receptor de llnfocltos B);

(28) CD79a (CD79A, CD79a, a asociado a Inmunoglobulina;

(29) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkltt);

(30) HLA-DOB (subunldad [3 de la molécula de clase II del MHC);

(31) P2X5 (canal Iónico 5 dependiente de ligando P2X del receptor purlnérglco);

(32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de los llnfocltos B, Lyb-2);

(33) LY64 (antígeno 64 de llnfocltos (RP105), proteina de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leuclna (LRR));

(34) FcRH1 (proteina 1 de tipo receptor de Fe);

(35) IRTA2 (translocación asociada al receptor 2 de la superfamllla de ¡nmunoglobullnas);

(36) TENB2 (supuesto proteoglucano transmembrana);

(37) PMEL17 (homólogo de plata; SILV; D12S53E; PMEL17; (SI); (SIL); ME20; gp100);

(38) TMEFF1 (proteina transmembrana con dominios de tipo EGF y dos dominios de tipo follstatlna 1; Tomorregullna-1 ; H7365; C9orf2; C90RF2; U19878; X83961 );

(39) GDNF-Ra1 (receptor ct1 de la familia GDNF; GFRA1 ; GDNFR; GDNFRA; RETL1 ; TRNR1 ; RETI L; GDNFR- ct1 ; GFR-ALPHA-1 ; U95847; BC014962);

(40) Ly6E (complejo de antígenos de llnfocltos 6, locus E; Ly67, RIG-E, SCA-2,TSA-1);

(41) TMEM46 (homólogo de shlsa 2 (Xenopus /aev/'s); SHISA2);

(42) Ly6G6D (complejo de antígenos de llnfocltos 6, locus G6D; Ly6-D, MEGT1);

(43) LGR5 (receptor 5 acoplado a la proteina G que contiene repeticiones ricas en leuclna; GPR49, GPR67);

(44) RET (proto-oncogén ret; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; (PTC); CDHF12; Hs.168114; RET51; RET- ELE1);

(45) LY6K (complejo de antígenos de llnfocltos 6, locus K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226);

(46) GPR19 (receptor 19 acoplado a la proteina G; Mm 4787);

(47) GPR54 (receptor KISS1 ; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12);

(48) ASPHD1 (dominio 1 que contiene aspartato p-hidroxilasa; LOC253982);

(49) Tlroslnasa (TYR; OCAIA; OCA1A; tlroslnasa; SHEP3);

(50) TMEM118 (proteina de dedo anular, transmembrana 2; RNFT2; FLJ14627) y

(51) GPR172A (receptor 172A acoplado a la proteina G; GPCR41 ; FLJ11856; D15Ertd747e).

15. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, y un dlluyente, un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 que comprende además una cantidad terapéuticamente

eficaz de un agente quimioterapéutico.

17. Un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 para su uso en terapia.

18. Un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un paciente el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco.

10 19. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco para su uso en un método de tratamiento de la reivindicación

18, en el que el paciente recibe un agente quimioterapéutico en combinación con el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco.

20. El uso de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10 en la fabricación de un 15 medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

21. Un artículo de fabricación que comprende:

un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14; un recipiente; y

20 un prospecto o una etiqueta que indiquen que el compuesto se puede usar para tratar el cáncer.