Condensación de fragmento de oligopéptido de cadena lateral protegida mediante el uso de subtilisinas en disolventes orgánicos.

Método para la síntesis enzimática de un oligopéptido, que comprende acoplar

i.

) un éster de oligopéptido que comprende 4 o más residuos de aminoácidos,

• que comprende al menos dos residuos de aminoácidos cada uno con una funcionalidad de cadena lateral que está protegida con un grupo protector, y que comprende un éster C10 terminal activado representado por la fórmula C(≥O)-O-CX2-C(≥O)N-R1R2, en donde cada X representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arilo y R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arilo y R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arilo o un aminoácido o un residuo de péptido con una funcionalidad de carboxiamida C-terminal o de ácido carboxílico, opcionalmente protegida en la funcionalidad de cadena lateral del residuo de aminoácido o uno o más de las funcionalidades de cadenas laterales del residuo de péptido,

• y en donde el éster de oligopéptido opcionalmente comprende una protección N-terminal, con

ii.) un nucleófilo de oligopéptido que comprende 4 o más residuos de aminoácidos,

• que comprende un grupo amina N-terminal, y al menos dos residuos de aminoácidos cada uno con una funcionalidad de cadena lateral, que está protegida con un grupo protector y

• en donde el nucleófilo de oligopéptido opcionalmente comprende protección C-terminal, cuyo acoplamiento se lleva a cabo en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos que comprende 0.1 % vol o menos de agua con relación a la cantidad total de líquidos en la cual tiene lugar predominantemente la reacción de acoplamiento, en presencia de una subtilisina y en donde se elimina el agua que se libera por la enzima durante la reacción de acoplamiento.

Condensación de fragmento de oligopéptido de cadena lateral protegida mediante el uso de subtilisinas en disolventes orgánicos

La invención se relaciona con un método para sintetizar enzimáticamente un oligopéptido.

Los péptidos, particularmente los oligopéptidos tienen muchas aplicaciones, por ejemplo, como producto farmacéutico, alimento o ingrediente alimenticio, agroquímico o ingrediente cosmético.

Se conoce que los oligopéptidos se pueden sintetizar químicamente en solución o en fase sólida a través de procesos altamente optimizados. Sin embargo, existen aún algunas limitaciones en la síntesis química de péptidos especialmente a gran escala. Por ejemplo, los péptidos más largos que 10-15 aminoácidos son difíciles de sintetizar en fase sólida porque tienden a formar estructuras terciarias (por el llamado "colapso hidrofóbico") lo que hace que el alargamiento del péptido sea muy problemático ya que se necesita un exceso grande de reactivos y bloques de construcción de aminoácidos. Además, la purificación del producto final es frecuentemente ineficiente en cuanto a costes debido a la presencia de cantidades significativas de péptidos de longitud similar. Por lo tanto,los péptidos más largos que 10 aminoácidos se sintetizan frecuentemente mediante una combinación de síntesis en fase sólida de fragmentos de oligopéptidos protegidos que posteriormente se condensan químicamente en solución, por ejemplo, una condensación 10+10 para hacer un péptido de 20 aminoácidos. El inconveniente principal de la condensación química de fragmento de oligopéptido protegido es que tras la activación del residuo de aminoácido C-terminal se produce racemización, excepto cuando se usan residuos Gly o Pro C-terminales. Por lo tanto, la estrategia de condensación química de fragmentos de oligopéptidos protegidos se limita a usar residuos Gly y Pro activados en posición C-terminal, o se tiene que lidiar con una purificación muy difícil debido a la formación de diastereoisómeros no deseados. En contraste, los acoplamientos de oligopéptidos catalizados por enzimas están completamente desprovistos de racemización y tienen otras muchas ventajas sobre la síntesis química de péptidos. Para aplicación industrial, un concepto de síntesis enzimática de péptidos basado en un enfoque cinético, es decir, mediante el uso de un componente carboxi activado es más atractivo (ver por ejemplo Sewald y H.-D. Jakubke, en: "Peptides: Chemistry and Biology", 1ra reimpresión, Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002).

La síntesis quimioenzimática de péptidos puede implicar el acoplamiento enzimático de fragmentos de oligopéptidos de cadena lateral sin protección los que se han sintetizado individualmente mediante el uso de la síntesis química, fermentación, o por una combinación de etapas de acoplamiento químico y enzimático. Algunos informes se han publicado sobre la condensación enzimática de oligopéptidos de cadena lateral completamente sin protección en ambiente acuoso (Kumaran y otros Protein Science, 2000, 9, 734; Bjórup y otros Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 891; Homandberg y otros Biochemistry, 1981,21,3387; Komoriya y otros Int. J. Pep. Prot. Res. 1980, 16, 433). Sin embargo, un inconveniente principal de tal condensación enzimática de fragmentos de oligopéptidos en sistemas acuosos es que tiene lugar la hidrólisis simultánea de los enlaces amida de los oligopéptidos y el éster C-terminal lo que conduce a bajos rendimientos y muchos productos secundarios. Para reducir la cantidad de hidrólisis de los costosos materiales de partida de oligopéptidos y productos de péptidos, frecuentemente se usa un gran exceso de nucleófilo de oligopéptidos (5-10 equivalentes) para incrementar la velocidad de condensación y por ello disminuyen las reacciones hidrolíticas secundarias, lo que económicamente resulta una estrategia muy poco atractiva. Para reducir más aun la cantidad de hidrólisis, se han realizado condensaciones enzimáticas de fragmentos de oligopéptidos completamente sin protección en mezclas de reacción poco acuosas mediante el uso de codisolventes orgánicos que muestran rendimientos superiores de producto y menos reacciones hidrolíticas secundarias (Slomczynska y otros Biopolymers,1992, 32, 1461; Xaus y otros Biotechnol. Tech. 1992, 6, 69; Nishino y otros Tet. Lett. 1992, 33, 3137; Clápes y otros Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 245,Kolobanova y otros Russian J. of Bioorg. Chemistry 2000, 26, 6, 369). Puesto que en estos informes se requiere una cantidad significativa de agua para la actividad de la enzima (entre 1-5 % vol de agua), las reacciones hidrolíticas secundarias no se eliminan aún completamente. Para eliminar prácticamente las reacciones hidrolíticas secundarias enzimáticas, se pueden usar mezclas de reacción casi anhidras (por debajo de 1 % vol de agua). Sin embargo existen solamente muy pocas enzimas activas y estables bajo estas condiciones (G. Carrea, S. Riva, Fundamentáis of Biocatalysis in Neat Organic Solvents, Whiley, 2008) y los oligopéptidos que contienen funcionalidades de cadena lateral sin protección usualmente exhiben muy poca o ninguna solubilidad en estos disolventes orgánicos. Se han divulgado algunos informes sobre la síntesis enzimática de di- y tri-péptidos en disolventes orgánicos anhidros (por ejemplo, Chen y otros J. Org. Chem. 1992, 57, 6960; Nuijens y otros J.M.d. Cat:B. 2001, 71, 79) pero no se han realizado condensaciones de fragmentos de oligopéptidos. Aunque los disolventes casi anhidros prácticamente eliminan las reacciones hidrolíticas secundarias, más frecuentemente se pierde mucha actividad de la enzima y así las reacciones de acoplamiento de oligopéptidos tienden a ser muy lentas e incompletas.

Como se conoce a partir de la síntesis química de péptidos en fase de solución, los oligopéptidos protegidos son bien solubles en varios disolventes orgánicos puros debido a sus caracteres hidrofóbicos. Así, la condensación enzimática de fragmentos de oligopéptidos en disolventes orgánicos anhidros se podría ejecutar mediante el uso de oligopéptidos protegidos. Sin embargo, se podría esperar que los grupos protectores múltiples de cadena lateral hidrofóbica

esféricamente demandantes bloqueen el reconocimiento de la enzima. Por ejemplo, se informó por Yan y otros Tetrahedron, 2005, 61, 5933 que no se obtuvieron productos de condensación del todo con aminoácidos de cadena lateral protegida mediante el uso de la proteasa subtilisina A. De acuerdo con sus observaciones, la subtilisina A no acepta residuos de aminoácidos que portan grupos protectores voluminosos en su funcionalidad de cadena lateral; sin embargo, cuando estos grupos protectores voluminosos se eliminan, los residuos de aminoácidos se aceptan fácilmente.

Gilí y otros (J. Am. Chem. Soc 1995, 117, 6175-6181) además describe un método para la síntesis enzimática de oligopéptidos. Sin embargo, la síntesis como se describe por GUI y otros requiere enzimas específicas para cada adición individual de aminoácidos para sintetizar fragmentos, y otra enzima una vez más para el acoplamiento de dos fragmentos. El hecho de que diferentes enzimas se tienen que usar para el ensamblaje de los dos fragmentos y otra enzima para la condensación de los dos fragmentos, hace la aplicación de este proceso en una escala industrial poco atractiva. Por otra parte, la etapa de condensación del fragmento como se describe por Gilí y otros requiere la eliminación de dos grupos alilo protectores de cadena lateral de uno de los fragmentos, para permitir el uso de proteasa V8 para lograr el acoplamiento. Así, el proceso como se describe por Gilí y otros no es un proceso versátil para la preparación de oligopéptidos que comprende 8 residuos de aminoácidos o más.

Así, aún existe una necesidad para un proceso enzimático simple versátil para la síntesis de péptidos que comprende al menos 8 residuos de aminoácidos, con ninguna o pocas reacciones hidrolíticas secundarias. Tal un proceso enzimático ahora se ha encontrado sorprendentemente.

En el marco de esta invención, un éster de oligopéptido i) se define como un éster de oligopéptido que comprende 4 o más residuos de aminoácidos,

que comprende al menos dos residuos de aminoácidos cada uno con una funcionalidad de cadena lateral que está protegida con un grupo protector, y que comprende un éster C-terminal activado representado por la fórmula C(=0)-0-CX2-C(=0)N-RiR2, en donde cada X independientemente representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arilo y Ri representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arilo y R2 representa un átomo de hidrógeno la funcionalidad de la cadena lateral del residuo de aminoácido o en uno o más de las funcionalidades de cadena... [Seguir leyendo]

1. Método para la síntesis enzimática de un oligopéptido, que comprende acoplar

i. ) un áster de oligopéptido que comprende 4 o más residuos de aminoácidos,

- que comprende al menos dos residuos de aminoácidos cada uno con una funcionalidad de cadena lateral que está protegida con un grupo protector, y que comprende un áster C- terminal activado representado por la fórmula C(=0)-0-CX2-C(=0)N-RiR2, en donde cada X representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arito y Ri representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arito y R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o un grupo arito o un aminoácido o un residuo de péptido con una funcionalidad de carboxiamida C-terminal o de ácido carboxílico, opcionalmente protegida en la funcionalidad de cadena lateral del residuo de aminoácido o uno o más de las funcionalidades de cadenas laterales del residuo de péptido,

- y en donde el áster de oligopéptido opcionalmente comprende una protección A/-terminal,

con

ii. ) un nucleófilo de oligopéptido que comprende 4 o más residuos de aminoácidos,

- que comprende un grupo amina /V-terminal, y al menos dos residuos de aminoácidos cada uno con una funcionalidad de cadena lateral, que está protegida con un grupo protector y

- en donde el nucleófilo de oligopéptido opcionalmente comprende protección C-terminal,

cuyo acoplamiento se lleva a cabo en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos que comprende 0.1 % vol o menos de agua con relación a la cantidad total de líquidos en la cual tiene lugar predominantemente la reacción de acoplamiento, en presencia de una subtilisina y en donde se elimina el agua que se libera por la enzima durante la reacción de acoplamiento.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el éster de oligopéptido se obtuvo mediante la síntesis en fase sólida mediante el uso de un conector.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el conector es un conector Sieber o Ramage.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde al menos 50% de todas las funcionalidades de cadena lateral están protegidas.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde cada X representa un átomo de hidrógeno.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde ambos Ri y R2 representan un átomo de hidrógeno.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde Ri representa un átomo de hidrógeno y R2 representa un residuo de aminoácido o residuo de péptido con una funcionalidad de carboxiamida o ácido carboxílico C-terminal, opcionalmente protegida en la funcionalidad de cadena lateral del residuo de aminoácido o en una o más funcionalidades de cadena lateral del residuo de péptido.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde todas las funcionalidades de cadena

lateral del éster de oligopéptido y el nucleófilo de oligopéptido están protegidos excepto la funcionalidad de cadena lateral del residuo de aminoácido C-terminal del éster de oligopéptido.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la subtilisina es un mutante de una

subtilisina silvestre.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la subtilisina se usa en una forma inmovilizada.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la subtilisina se inmoviliza en forma de un agregado enzimático reticulado (CLEA).

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el disolvente orgánico o la mezcla de disolventes orgánicos comprende MTBE, THF, Me-THF, 1,2-dimetoxietano, diclorometano, 1,2-dicloroetano, TFE, DMF, NMP, DMA o DMSO.

13. Método de acuerdo a reivindicación 12, en donde el disolvente orgánico o la mezcla de disolventes orgánicos comprende MTBE, una mezcla de MTBE con DMF o NMP o DMA o DMSO, diclorometano o una mezcla de diclorometano con DMF o NMP o DMA o DMSO.

14. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el disolvente orgánico o la mezcla de disolventes orgánicos tiene un contenido de agua de 0.05 %vol o menor.

15. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el agua que se libera por la enzima se elimina continuamente.

16. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el agua que se libera por la enzima se elimina mediante el uso de tamices moleculares.

17. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la reacción de acoplamiento se realiza en la ausencia de una sal.