Composiciones de minicélulas y procedimientos.

Una minicélula eubacteriana completamente intacta derivada de una célula progenitora eubacteriana,

en la que la minicélula comprende un compuesto biológicamente activo y muestra un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, en la que el compuesto biológicamente activo y el anticuerpo o derivado de anticuerpo son exógenos para la célula progenitora y diferentes el uno del otro.

Composiciones de minicélulas y procedimientos La invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción de células arqueabacterianas, eubacterianas acromosómicas y eucariotas anucleadas que se usan como, por ejemplo, agentes terapéuticos y/o diagnósticos, reactivos en el descubrimiento de fármacos y proteómica funcional, herramientas de investigación, así como en otras aplicaciones.

La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se proporciona para ayudar en la comprensión de la invención pero no se admite que describa o constituya técnica anterior a la invención. Los contenidos de los artículos, patentes, y solicitudes de patente, y todos los demás documentos e información disponible electrónicamente mencionada o citada en esta solicitud, se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad en la misma medida que si se indicase específica e individualmente que cada publicación se incorpora por referencia. Los solicitantes se reservan el derecho a incorporar físicamente a esta solicitud cualquiera y todos los materiales e información de cualquiera de dichos artículos, patentes, solicitudes de patente, u otros documentos.

Las minicélulas son células acromosómicas que son productos de división celular aberrante, y contienen ARN y proteínas, pero muy poco o ningún ADN cromosómico. Clark-Curtiss y Curtiss III, Analysis of Recombinant DNA Using Escherichia coli Minicells, 101 Methods in Enzymology 347 (1983) ; Reeve y Mendelson, Minicells of Bacillus subtilis. A new system for transport studies in absence of macromolecular biosynthesis, 352 Biochim. Biophys. Acta 298-305 (1974) . Las minicélulas son capaces de la síntesis dirigida por plásmidos de polipéptidos discretos en ausencia de síntesis dirigida por ARNm a partir del cromosoma bacteriano. Meagher y col., Protein Expression in E. coli Minicells by Recombinant Plasmid, 10 Cell 521, 523 (1977) ; Roozen y col., Synthesis of Ribonucleic Acid and Protein in Plasmid-Containing Minicells of Escherichia coli K-12, 107 (1) J. of Bacteriology 21 (1971) ; y Curtiss III, Research on bacterial conjugation with minicells and minicell-producing E. coli strains, En: Microbial Drug Resistance, Editores Susumu Mitsuhashi y Hajime Hashimoto, p. 169 (Baltimore: University Park Press 1976) . Las descripciones tempranas de minicélulas incluyen aquellas de Adler y col., Genetic control of cell division in bacteria, 154 Science 417 (1966) , y Adler y col. (Miniature Escherichia coli cells deficient in DNA, 57 Proc. Nat. Acad. Sci (Wash.) 321 (1967) ) . Sin embargo, el descubrimiento de la producción de minicélulas puede seguirse discutiblemente hasta la década de 1930 (Frazer y Curtiss III, Production, Properties and Utility of Bacterial Minicells, 69 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1-3 (1975) ) .

Se han usado minicélulas procariotas (también conocidas como eubacterianas) para producir varias proteínas eubacterianas. Véanse, por ejemplo, Michael Gaael, y col., The kdpF Subunit Is Part of the K+-translocating Kdp Complex of Escherichia coli and Is Responsible for Stabilization of the Complex in vitro, 274 (53) Jn. of Biological Chemistr y 37901 (1999) ; Harlow, y col., Cloning and Characterization of the gsk Gene Encoding Guanosine Kinase of Escherichia coli, 177 (8) J. of Bacteriology 2236 (1995) ; Carol L. Pickett, y col., Cloning, Sequencing, and Expression of the Escherichia coli Cytolethal Distinding Toxin Genes, 62 (3) Infection & Immunity 1046 (1994) ; Raimund Eck y Jorn Belter, Cloning and characterization of a gene coding for the catechol 1, 2 dioxygenase of Arthrobacter sp. mA3, 123 Gene 87 (1993) ; Andreas Schlossser, y col., Subcloning, Nucleotide Sequence, and Expression of trkG, a Gene That Encodes an Integral Membrane Protein Involved in Potassium Uptake via the Trk System of Escherichia coli, 173 (10) J. of Bacteriology 3170 (1991) ; Mehrdad Jannatipour, y col., Translocation of Vibrio harveyi N, N’-Diacetylchitobiase to the Outer Membrane of Escherichia coli 169 (8) J. of Bacteriology 3785 (1987) ; y Jacobs y col., Expression of Mycobacterium leprae genes from a Streptococcus mutans promoter in Escherichia coli K-12, 83 (6) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1926 (1986) ;

Se han usado varias bacterias, o se ha propuesto su uso, como vectores de administración de genes a células de mamífero. Para revisiones, véase Grillot-Courvalin y col., Bacteria as gene deliver y vectors for mammalian cells, 10 Current Opinion in Biotechnology 477 (1999) ; Johnsen y col., Transfer of DNA from Genetically Modified Organisms (GMOs) , Biotechnological Institute, 1-70 (2000) ; Sizemore y col., Attenuated Shigella as a DNA deliver y vehicle for DNA-mediated immunization, 270 (5234) Science 299 (1995) ; Patrice Courvalin, y col., Gene transfer from bacteria to mammalian cells, 318 C. R. Acad. Sci.1207 (1995) ; Sizemore, y col., Attenuated bacteria as a DNA deliver y vehicle for DNA-mediated immunization, 15 (8) Vaccine 804 (1997) .

La patente de Estados Unidos Nº 4.190.495 que se publicó el 26 de febrero de 1980, de Curtiss se refiere a cepas productoras de minicélulas de E. coli que se afirma que son útiles para la expresión recombinante de proteínas.

La patente de Estados Unidos Nº 4.311.797 que se publicó el 19 de enero de 1982 de Khachatourians afirma que se refiere a una vacuna basada en minicélulas. Se afirma que la vacuna induce la producción de anticuerpos contra células de E. coli enteropatogénica en ganado y se afirma que es eficaz contra la enteritis coliforme.

Se han descrito minicélulas eubacterianas que expresan inmunógenos de otros procariotas. Purcell y col., Molecular cloning and characterization of the 15-kilodalton major immunogen of Treponema pallidum, Infect. Immun. 57:3708, 1989.

En "Biotechnology: Promise... and Peril" (IDRC Reports 9:4-7, 1980) los autores, Fleur y y Shirkie afirman que George Khachatourians de la Unveristy of Saskatchewan, Canadá "está trabajando en una vacuna contra el cólera usando

minicélulas". Se dice que las minicélulas contienen "genes del agente patógeno", y los "antígenos patógenos son transportados sobre la superficie de las minicélulas" (p. 5, párrafo que hace de puente entre las columnas central y derecha) .

Lundstrom y col., Secretion of Semliki Forest virus membrane glycoprotein E1 from Bacillus subtilis, Virus Res. 2:6983, 1985, describen la expresión de la proteína E1 del virus de eucariotas, virus Semliki Forest (VSF) , en minicélulas de Bacillus. La proteína E1 de VSF usada en estos estudios no es la proteína E1 nativa. Más bien, es una proteína de fusión en la que la secuencia de señal N-terminal y el dominio transmembrana C-terminal se han eliminado y reemplazado con secuencias de señal de un gen de Bacillus amyloliquefaciens. Los autores afirman que "E1 se transloca a través de la membrana celular y se secreta adecuadamente" (p. 81, I.I. 19-20) , e indican que "ha sido difícil expresar proteínas de membrana virales en procariotas" (p. 81, I. 27) .

La patente de Estados Unidos Nº 4.237.224 que se publicó el 2 de diciembre de 1980, de Cohen y Boyer, describe la expresión de ADN de X. laevis en minicélulas de E. coli.

La solicitud de Patente de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/293.566 (Nº de expedientes del agente 0788530401 y 089608-0201) , que tiene por título "Minicell Compositions and Methods", y que se registró el 24 de mayo de 2001, por Sabbadini, Roger A., Berkley, Neil L., y Klepper, Robert E., y se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.

Jespersen y col. describen el uso de "proteoliposomas" para generar anticuerpos para el receptor de AMPA. Jespersen LK, Kuusinen A, Orellana A, Keinanen K, Engberg J. Use of proteoliposomes to generate phage antibodies against native AMPA receptor. Eur J Biochem. Mar. de 2000; 267 (5) :1382-9

La invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción y uso de minicélulas, incluyendo, pero sin limitación, minicélulas eubacterianas, en aplicaciones tales como agentes diagnósticos, terapéuticos, de investigación, selección de compuestos y descubrimiento de fármacos, así como agentes para la administración de ácidos nucleicos y otros compuestos bioactivos a células.

Las minicélulas son derivados de células que carecen de ADN cromosómico y que en ocasiones se citan como células anucleadas. Debido a que las células eubacterianas y arqueobacterianas, a diferencia de las células eucariotas, no tienen un núcleo (un orgánulo diferenciado que contiene los cromosomas) , estas minicélulas no eucariotas se describen con más precisión como "sin cromosomas" o "acromosómicas", en oposición a "anucleadas". Sin embargo, los expertos en la materia a menudo usan el término "anucleada"... [Seguir leyendo]

1. Una minicélula eubacteriana completamente intacta derivada de una célula progenitora eubacteriana, en la que la minicélula comprende un compuesto biológicamente activo y muestra un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, en la que el compuesto biológicamente activo y el anticuerpo o derivado de anticuerpo son exógenos para la célula progenitora y diferentes el uno del otro.

2. La minicélula de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo es un anticuerpo.

3. La minicélula de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo es un anticuerpo, derivado.

Figura 2