Bacteria productora de alcohol isopropílico y método para producir alcohol isopropílico.

Escherichia coli productora de alcohol isopropilico que comprende al menos un gen de sacarosa hidrolasa que pertenece a un grupo de genes de sistema no PTS de sacarosa,

y un sistema de produccion de alcohol isopropilico conferido o mejorado en donde la Escherichia coli productora de alcohol isopropilico es una Escherichia coli a la que se ha conferido actividad acetoacetato descarboxilasa, actividad alcohol isopropilico deshidrogenasa, actividad CoA transferasa, y actividad tiolasa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2010/065770.

Solicitante: MITSUI CHEMICALS, INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 5-2, HIGASHI-SHIMBASHI 1-CHOME MINATO-KU TOKYO 105-7117 JAPON.

Inventor/es: TAKAHASHI, HITOSHI, MORISHIGE,TAKASHI, WADA,MITSUFUMI, TAKEBAYASHI,NOZOMI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12P7/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › acíclicos.

PDF original: ES-2538078_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Bacteria productora de alcohol isopropílico y método para producir alcohol isopropílico Campo de la técnica

La presente invención hace referencia a una bacteria que produce alcohol isopropílico y a un método para producir alcohol isopropílico.

Estado del arte previo

El propileno es una importante materia prima básica para las resinas sintéticas tales como el polipropileno y para productos petroquímicos, y se utiliza ampliamente por ejemplos para amortiguadores de automóviles, envases alimenticios, películas, e instrumentos médicos.

El alcohol isopropílico producido a partir de materias primas procedentes de plantas puede convertirse en propileno mediante un proceso de deshidratación. Por lo tanto, el alcohol isopropílico es una materia prima prometedora neutra en carbono para el propileno. El protocolo de Kyoto pidió a las naciones industrializadas que redujeran sus emisiones totales de dióxido de carbono a partir de los niveles de 199 en un 5 por ciento para 28-212. Por lo tanto, el propileno neutro en carbono es en la actualidad extremadamente importante debido a su versatilidad, en vista del medio ambiente global.

Ya se conocen bacterias que asimilan las materias primas procedentes de plantas y producen alcohol isopropílico. Por ejemplo, el documento WO 29/8377 revela una bacteria que ha sido modificada para lograr una gran producción de alcohol isopropílico a partir de glucosa como materia prima, y describe que la bacteria es un biocatalizador excelente para la producción industrial de alcohol isopropílico.

Se sabe que la Escherichia coli no puede asimilar la sacarosa. Sin embargo, resultaría ventajoso desde un punto de vista industrial si la sacarosa, que entre las materias primas procedentes de las plantas no es costosa, pudiera utilizarse.

Atendiendo al conocimiento tradicional, el mecanismo de asimilación de la sacarosa por parte de microorganismos se clasifica en líneas generales en dos sistemas, es decir, el sistema PTS de sacarosa (fosfoenolpiruvato: sistema de fosfotransferasa de carbohidratos) y el sistema no-PTS de sacarosa (por ejemplo, JP-A No. 21-346578). Se sabe que el sistema no PTS de sacarosa está compuesto de cuatro factores, es decir, cscB (que incorpora sacarosa), cscA (que descompone la sacarosa en microorganismos), cscK (que fosforila la fructosa), y cscR (que controla las expresiones de cscB, A, y K). En Biotechnology Letters, Vol. 27, pp. 1891-1896 (25), se describe que los genes de estos cuatro factores fueron introducidos en Escherichia coli productora de ácido D-láctico utilizando plásmidos, produciendo de ese modo ácido D-láctico a partir de sacarosa.

Además, se sabe que el sistema PTS de sacarosa está compuesto de cinco factores, es decir, scrA (que incorpora sacarosa); scrY (que fosforila sacarosa); scrB (que descompone sacarosa en microorganismos); scrR (que controla las expresiones de scrA, Y, y B), y scrK (que fosforila la fructosa).

Cuando una habilidad que un microorganismo no posee debe ser introducida en dicho microorganismo, se estudia generalmente la introducción de un gen que expresa dicha habilidad. En el caso de la habilidad para la asimilación de sacarosa, los ADN de los factores mencionados anteriormente presentan tamaños desde 9 a 15 pb, y el tamaño total del ADN requerido para expresar los genes de las cuatro enzimas (tiolasa, transferasa CoA, acetoacetato descarboxilasa, y alcohol isopropílico deshidrogenasa), necesario para la elevada producción de alcohol isopropílico es de aproximadamente 48 pb. En otras palabras, la introducción de un ADN con un tamaño de aproximadamente 93 pb sería necesaria para conferir tanto la habilidad de asimilación de sacarosa como la habilidad productora de IPA a la Escherichia coli.

Sin embargo, la introducción simultánea de la misma en la Escherichia coli es extremadamente difícil, ya que el tamaño de ADN a ser introducido excedería el límite superior del tamaño de ADN que el plásmido puede alojar. Incluso si se utilizaran dos tipos de vectores plasmídicos para reducir el tamaño del ADN de cada plásmido a 1 pb o menos, cualquiera o ambos de los dos tipos de plásmidos introducidos en la Escherichia coli sería susceptible de ser eliminado durante el crecimiento repetitivo. La Escherichia coli necesitaría estar expuesta de forma continua a una sustancia antibiótica costosa como un marcador de selección para evitar el anterior problema, y tal necesidad no resulta adecuada para la producción a escala industrial.

Por consiguiente, resulta difícil conferir simultáneamente tanto la habilidad de asimilar la sacarosa como la habilidad de una elevada producción de alcohol isopropílico a la Escherichia coli.

En Can. J. Microbiol., Vol. 45, pp. 18-422 (1999) se revela que como resultado de la introducción de sacarosa hidrolasa (cscA) sola en la Escherichia coli, la Escherichia coli crecía utilizando sacarosa como materia prima. Sin embargo, el artículo también demuestra que cuando el gen cscA se expresaba de forma elevada mediante tecnología de recombinación genética, casi todos los cscA estaban presentes en las células. Por tanto, el cscA (invertasa) trabaja en el interior de las células en lugar de en el exterior de las células, y no puede esperarse que el cscA descomponga la sacarosa en el exterior de las células.

Un ejemplo de material de producción a partir de la sacarosa utilizando Escherichia coli, la cual no puede asimilar sacarosa, es la producción de triptófano utilizando sacarosa como materia prima (por ejemplo, JP-A No. 21- 346578). Sin embargo, en este ejemplo, se demuestra que la introducción de un grupo de genes que incluya al menos cscA, cscB, y cscK es necesario para conferir la habilidad para producir aminoácidos a partir de la sacarosa a la Escherichia coli.

Resumen de la invención

Problema técnico a resolver por la invención

Tal como se ha tratado anteriormente, ha sido extremadamente difícil conferir simultáneamente la habilidad de asimilar sacarosa y la habilidad de producir alcohol isopropílico de forma elevada a la Escherichia coli, la cual no puede asimilar la sacarosa, debido al tamaño excesivamente grande del ADN a ser introducido.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico y un método para producir alcohol isopropílico que sea de utilidad para la producción eficiente de alcohol isopropílico a partir de la sacarosa, que no sea costoso y que presente un valor de utilidad industrial elevado.

La presente invención proporciona una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico y un método para producir alcohol isopropílico según como se describe a continuación.

Medios para resolver el problema

[1] Una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que incluye al menos un gen de sacarosa hidrolasa que pertenece a un grupo de genes de un sistema no PTS de sacarosa, y un sistema de producción de alcohol isopropílico conferido o aumentado en donde la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico es una Escherichia coli a la que se ha conferido una actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, una actividad Co Atransferasa, y una actividad tiolasa.

[2] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según [1], que incluye únicamente el gen de sacarosa hidrolasa de entre los genes que pertenecen a un grupo de genes de un sistema no PTS de sacarosa.

[3] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según [1], en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa, la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, la actividad CoA transferasa, y la actividad tiolasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican las respectivas enzimas que se obtienen de al menos una seleccionada del grupo que consiste en bacterias del género Clostridium, bacterias del género Bacillus, y bacterias del género Escherichia.

[4] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según [1], en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa y la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican las respectivas enzimas que se obtienen de una bacteria o bacterias del género Clostridium, y la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican respectivas enzimas que se obtienen de una bacteria o bacterias del género Escherichia.

[5] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según [1], en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa se obtiene mediante la introducción de un gen que codifica una enzima procedente de Clostridium acetobutylicum, la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa se obtiene mediante la introducción... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Escherichia cotí productora de alcohol isopropílico que comprende al menos un gen de sacarosa hidrolasa que pertenece a un grupo de genes de sistema no PTS de sacarosa, y un sistema de producción de alcohol isopropílico conferido o mejorado en donde la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico es una Escherichia colia la que se ha conferido actividad acetoacetato descarboxilasa, actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, actividad CoA transferasa, y actividad tiolasa.

2. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 1, que comprende únicamente el gen de sacarosa hidrolasa de entre los genes que pertenecen al grupo de genes de sistema no PTS de sacarosa.

3. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 1, en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa, la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, la actividad CoA transferasa, y la actividad tiolasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican respectivas enzimas que se obtienen de al menos una seleccionada del grupo que consiste en bacterias del género Clostridium, bacterias del género Bacillus, y bacterias del género Escherichia.

4. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 1, en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa y la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican respectivas enzimas que se obtienen a partir de una bacteria o bacterias del género Clostridium, y la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican respectivas enzimas que se obtienen a partir de una bacteria o bacterias del género Escherichia.

5. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 1, en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa se obtiene mediante la introducción de un gen que codifica una enzima procedente de Clostridium acetobutylicum, la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa se obtiene mediante la introducción de un gen que codifica una enzima procedente de Clostridium beijerinckii, y la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se obtienen mediante la introducción de genes que codifican respectivas enzimas procedentes de Escherichia coli.

6. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 1, en donde un gen que codifica la acetoacetato descarboxilasa, un gen que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa, y el gen que codifica la sacarosa hidrolasa han sido introducidos utilizando al menos un plásmido, y la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se obtienen a partir de genes en la Escherichia coli hospedadora.

7. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 6, en donde un promotor para expresar un gen que codifica la CoA transferasa y un gen que codifica la tiolasa es al menos uno de promotor gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa o un promotor serina hidroximetil transferasa.

8. Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según la reivindicación 1, en donde la actividad acetoacetato descarboxilasa, la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se obtienen todas mediante la introducción de genes que codifican respectivas enzimas procedentes de una bacteria o bacterias del género Clostridium.

9. Un método para producir alcohol isopropílico, que comprende producir alcohol isopropílico a partir de materia prima procedente de plantas que contiene sacarosa utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.


 

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