Aumento de los niveles de alcaloides nicotínicos.

Procedimiento para incrementar la nicotina en una planta de Nicotiana,

que comprende sobreexpresar un gen NBB1 en relación con una planta de control, en el que dicho gen NBB1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en la SEQ ID NO: 2.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11187201.

Solicitante: 22nd Century Limited, LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 9530 Main Street Clarence, NY 14031 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: HASHIMOTO,TAKASHI, KAJIKAWA,M.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01H5/00 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.Plantas con flores, es decir, angiospermas.
  • A24B15/18 A […] › A24 TABACO; PUROS; CIGARRILLOS; ARTICULOS PARA FUMADORES.A24B FABRICACION O PREPARACION DEL TABACO PARA FUMAR O PARA MASCAR; TABACO; TABACO PARA ASPIRAR.A24B 15/00 Características químicas o tratamiento del tabaco; Sucedáneos del tabaco (A24B 3/00 tiene prioridad). › Tratamiento del tabaco o de los sucedáneos del tabaco.
  • C07K14/415 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
  • C12N15/82 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.

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Aumento de los niveles de alcaloides nicotínicos.

Fragmento de la descripción:

Aumento de los niveles de alcaloides nlcotínlcos 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y la regulación de la síntesis de alcaloides nicotínicos. Por lo tanto, la Invención se refiere, por ejemplo, a metodología y construcciones para aumentar el nivel de alcaloides nlcotínlcos en una planta de Nicotiana y a células que se manipulan por Ingeniería

genética para producir alcaloides nlcotínlcos y compuestos relacionados, cuando de otro modo no los producirían.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Actualmente se conocen varias enzimas de la biosíntesis de nicotina. Por ejemplo, se ha clonado el 15 gen de la quinolato-fosforrlboslltransferasa de tabaco (QP7), véanse la patente de los EE. UU. n° 6.423.520 y

Sinclair y col., Plant Mol. Biol. 44: 603-17 (2000), y su supresión proporciona reducciones significativas de nicotina en plantas transgénicas de tabaco. Xle y col., Recent Advances in Tobacco Science 30: 17-37 (2004). Igualmente, se ha observado que la supresión de una secuencia endógena de putrescina-metiltransferasa (PMT) reduce los niveles de nicotina pero aumenta los niveles de anatabina de dos a seis veces. Hibi y col., Plant Cell 6: 723-35 20 (1994); Chlntapakorn y Hamlll, Plant Mol. Biol. 53: 87-105 (2003); Steppuhn y col., PLoS Biol. 2:8:e217: 1074-1080 (2004).

[0003] Mientras que los esfuerzos de investigación anteriores se han centrado en el uso de enzimas de la biosíntesis de nicotina para reducir la nicotina en las plantas, muy pocas investigaciones han abordado el papel de

las enzimas de la biosíntesis de nicotina en el aumento de la síntesis de alcaloides nicotínicos. Esta falta de datos de regulación por aumento puede atribuirse al hecho de que la sobreexpresión de un gen conocido de la biosíntesis de alcaloides nicotínicos, como PMT o QPT, no tiene necesariamente que aumentar la producción y acumulación de metabolitos secundarios en la planta. Es decir, no necesariamente porque la regulación por disminución de un gen de la biosíntesis de alcaloides nlcotínlcos reduzca la producción y acumulación de alcaloides, la sobreexpresíón de 30 este mismo gen de biosíntesis de alcaloides nlcotínlcos va a aumentar la producción y acumulación de alcaloides nlcotínlcos.

[0004] Debido a la escasez de investigación, existe la necesidad de identificar genes que aumenten la biosíntesis y acumulación de la nicotina. Por ejemplo, dado que los alcaloides nicotínicos desempeñan un papel

Importante en la protección de las plantas contra insectos y herbívoros, probablemente sea ventajoso aumentar la síntesis de alcaloides nicotínicos en una planta huésped. Desde el punto de vista de los herbívoros, el aumento de la síntesis y acumulación de nicotina proporcionará un modo respetuoso con el medio ambiente de intervenir en las interacciones entre planta y plaga.

[0005] Desde el punto de vista de la industria tabaquera, en que la nicotina es el componente física y fisiológicamente activo del humo de los cigarrillos, puede ser ventajoso aumentar el contenido de nicotina en el tabaco por ingeniería genética. Los estudios de investigación demuestran que cuando se añade físicamente nicotina adicional al tabaco de los cigarrillos de una fuente externa, los fumadores inhalan menor cantidad de los componentes más dañinos del humo como alquitrán y monóxido de carbono. Véase Armitage y col., 45 Psychopharmacology 96: 447-53 (1988), Fagerstróm, Psychopharmacology 77: 164-67 (1982), Russell, Nicotine and Public Health 15: 265-84 (2000) y Woodman y col., European Journal of Respiratory Disease 70: 316-21 (1987). Asimismo, un informe del Instituto de Medicina (IOM) de los EE. UU. sobre productos potenciales de exposición reducida (PREP) concluyó que otra estrategia general para reducir el daño del tabaco es la retención de nicotina a niveles agradables o adictivos mientras se reducen los componentes más tóxicos. Véase CLEARING THE SMOKE, 50 ASSESSING THE SCIENCE BASE FOR TOBACCO HARM REDUCTION, IOM, en la página 29 (2001); publicación a la que la industria del tabaco normalmente hace referencia como "informe del IOM".

[0006] Además de las aplicaciones más tradicionales para productos con aumento de nicotina, como cigarrillos y otros productos de tabaco, algunos estudios farmacológicos recientes sugieren un papel terapéutico 55 para la nicotina y compuestos relacionados. Por ejemplo, varios grupos de investigación están estudiando actualmente fármacos que reconocen selectivamente receptores de nicotina como un modo de tratar deficiencias cognitivas como la enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia y la pérdida de memoria relacionada con la edad. Slnger, "The Upslde to Nicotine", Technology Revlew (28 de julio de 2006). Se ha demostrado que ligandos de receptores de acetilcolina, como la nicotina, tienen efectos sobre la atención, la cognición, el apetito, la drogadicción,

la memoria, la actividad extrapiramidal, la actividad cardiovascular, el dolor y la motilidad y actividad gastrointestinal. Patente de los EE. UU. n° 5.852.041. Por lo tanto, existen beneficios terapéuticos de la nicotina y los compuestos relacionados y por lo tanto existe la necesidad de mejores procedimientos para su producción.

[0007] Por consiguiente, existe una necesidad continua de identificar genes adicionales cuya expresión pueda modificarse para aumentar el contenido de alcaloides nicotínicos en las plantas, en particular de nicotina en plantas de N. tabacum, así como para producir nicotina y compuestos relacionados en células no productoras de nicotina.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] Existen cuatro genes, A622, NBB1, PMT y QPT, en los que se puede influir para aumentar los niveles de alcaloides nicotínicos en plantas de Nicotiana, así como para sintetizar alcaloides nicotínicos y compuestos relacionados en células no productoras de nicotina.

[0009] En un aspecto, se da a conocer un procedimiento para aumentar los alcaloides nicotínicos, como nicotina, en una planta de Nicotiana, mediante la sobreexpresión de al menos uno de A622 y NBB1 con respecto a una planta de control. En una realización, se sobreexpresa NBB1. En otra realización, se sobreexpresan A622 y NBB1. En otra realización más, se sobreexpresan A622 y NBB1 y al menos uno de QPT y PMT también se sobreexpresa. Además, se pueden sobreexpresar QPT y A622.

[0010] También se describe una planta con aumento de nicotina y productos derivados de la misma, que se produce por cualquier procedimiento de sobreexpresión de uno o más de A622, NBB1, PMT y QPT También se dan a conocer productos se seleccionan del grupo que consta de un cigarrillo, un producto farmacéutico y un producto

nutracéutico.

[0011] Se da a conocer un procedimiento para la producción de alcaloides nicotínicos, que comprende la expresión heteróloga de NBB1 y A622 en una planta o célula que de otro modo no produce alcaloides nicotínicos. La expresión de NBB1 y A622 puede tener lugar en una célula seleccionada del grupo que consta de una célula bacteriana, de levadura, hongo filamentoso, alga, mamífero o insecto.

[0012] También se da a conocer una planta con aumento de alcaloides nicotínicos, producida por la expresión heteróloga de NBB1 y A622 en una planta o célula que de otro modo no produce alcaloides nicotínicos. También se da a conocer un producto con alcaloides nicotínicos obtenido por la expresión heteróloga de NBB1 y A622 en una planta o célula que de otro modo no produce alcaloides nicotínicos.

[0013] Se da a conocer un procedimiento para la producción comercial de un alcaloide nicotínico que comprende (a) proporcionar una pluralidad de células que expresan A622 y NBB1 y (b) obtener dicho alcaloide nicotínico de dicha pluralidad.

[0014] También se da a conocer un procedimiento para aumentar la nicotina en una planta, que comprende la sobreexpresión de PMT y QPT con respecto a una planta de control. En esta descripción, se produce una planta con aumento de nicotina. En esta descripción, se produce un producto con aumento de nicotina.

[0015] Se da a conocer un procedimiento para la producción de la enzima NBB1 que comprende la 45 transformación de una célula con una molécula de ácido nucleico aislada que codifica NBB1 y el cultivo de la célula transformada en condiciones en las que se produce la enzima NBB1. Las células transformadas pueden seleccionarse del grupo que consta de células bacterianas, de levadura, hongos filamentosos, algas, plantas verdes y mamíferos.

[0016] Se da a conocer un procedimiento para aumentar la nicotina y el rendimiento en una planta de Nicotiana que comprende a) el cruzamiento de una planta de Nicotiana con aumento de nicotina... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para incrementar la nicotina en una planta de Nicotiana, que comprende sobreexpresar un gen NBB1 en relación con una planta de control, en el que dicho gen NBB1 es una secuencia de ácido nucleico que

codifica el polipéptido en la SEQ ID NO: 2.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende además sobreexpresar el gen A622.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, que comprende además sobreexpresar al menos uno de los genes QPT

y PMT.

4. Procedimiento para incrementar la nicotina en una planta de Nicotiana, según la reivindicación 1, que comprende:

(a) transformar una planta de Nicotiana con una construcción que comprende, en la dirección 5 a 3, un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que incrementa la síntesis de nicotina;

en el que dicho ácido nucleico es el gen NBB1 y se sobreexpresa el gen NBB1\

(b) regenerar plantas de Nicotiana transgénicas a partir de la planta transformada; y

(c) seleccionar una planta de Nicotiana transgénica que tiene un mayor contenido de nicotina en relación con una planta de control.

5. Procedimiento para incrementar la nicotina y el rendimiento en una planta de Nicotiana, según la reivindicación 1,

que comprende:

(a) transformar una planta de Nicotiana con (i) una primera construcción que comprende, en la dirección 5 a 3, un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que incrementa la síntesis de nicotina; y (ii) una segunda construcción que comprende,

en la dirección 5 a 3, un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que incrementa el rendimiento;

en el que dicha primera construcción comprende un ácido nucleico que codifica la enzima NBB1 y se sobreexpresa el gen NBB1\

(b) regenerar plantas de Nicotiana transgénicas a partir de la planta transformada; y

(c) seleccionar una planta de Nicotiana transgénica que tiene un mayor contenido de nicotina y un mayor rendimiento en relación con una planta de control.

6. Planta de Nicotiana que sobreexpresa el gen NBB1 en relación con una planta de control, en el que dicho gen NBB1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en la SEQ ID NO: 2.

7. Utilización de la planta, tal como se define en la reivindicación 6, para producir un producto con mayor nicotina, en la que dicho producto tiene mayores niveles de NBB1.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que dicho producto se selecciona del grupo que consiste en un 40 cigarrillo, un producto farmacéutico y un producto nutracéutico.


 

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