Atenuación sinérgica del virus de la estomatitis vesicular, vectores del mismo y composiciones inmunogénicas del mismo.

Un virus de la estomatitis vesicular (VSV) modificado genéticamente que comprende dos mutaciones que son una mutación del gen G truncado en el dominio citoplasmático y una mutación por barajado del gen N,

de forma que el gen N es desplazado desde su posición salvaje proximal al promotor en 3' a una posición más distal en el orden de los genes del VSV, en el que las dos mutaciones atenúan de forma sinérgica la patogenicidad del VSV, en el que la patogenicidad se define además como neurovirulencia.

Atenuación sinérgica del virus de la estomatitis vesicular, vectores del mismo y composiciones inmunogénicas del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la virología, la microbiología, las enfermedades infecciosas y la inmunología. Más particularmente, la invención se refiere a la atenuación sinérgica del virus de la estomatitis vesicular y a vectores del mismo mediante la combinación de diferentes clases de mutaciones.

Antecedentes de la invención

El virus de la estomatitis vesicular (VSV), un miembro de la familia Rhabdoviridae, tiene un genoma de ARN monocatenario no segmentado y de sentido negativo. Su genoma de once kb tiene cinco genes que codifican cinco proteínas estructurales del virus, la proteína de la nucleocápside (N), que se requiere en cantidades estequiométricas para la encapsidación del ARN replicado; la fosfoproteína(P), que es un cofactor de la ARN polimerasa dependiente de ARN (L); la proteína de la matriz (M) y la glicoproteína de unión (G) (por ejemplo, véase Gallione y col., 1981, Rose y Gallione, 1981; Rose y Schubert, 1987 y Schubert y col., 1985; patente de EE.UU. 6.33.886; patente de EE.UU. 6.168.943).

El VSV es un virus transmitido por artrópodos que se puede transmitir a varios huéspedes mamíferos, principalmente a ganado vacuno, caballos, cerdos y roedores. La infección por el VSV de seres humanos no es frecuente y en general es asintomática o se caracteriza por síntomas leves similares a los de la gripo que desaparecen en de tres a ocho días sin complicaciones. Dado que el VSV no se considera un patógeno humano y la inmunidad preexistente al VSV es infrecuente en la población de seres humanos, el desarrollo de vectores derivados del VSV ha sido un foco de atención en áreas tales como la de las composiciones inmunogénicas y la terapia génica. Por ejemplo, en estudios se ha establecido que el VSV puede servir como un vector muy eficaz para composiciones inmunogénicas que expresan la hemaglutinina del virus de la gripe (Roberts y col., 1999), la proteína H del virus del sarampión (Schlereth y col., 2) y las proteínas env y gag del VIH-1 (Rose y col., 21). Otras características del VSV que lo convierten en un vector atractivo incluyen: (a) la capacidad para replicarse sólidamente en cultivo celular; (b) la incapacidad de integrarse en el ADN de la célula huésped o sufrir recombinación genética; (c) la existencia de múltiples serotipos, lo que permite la posibilidad de estrategias de inmunización de sensibilización-refuerzo; (d) se pueden insertar genes de interés extraños en el genoma del VSV y se expresan abundantemente mediante la transcriptasa viral; y (e) el desarrollo de un sistema altamente especializado para el rescate de virus infecciosos a partir de una copia de ADNc del genoma del virus (patente de EE.UU. 6.33.886; patente de EE.UU. 6.168.943).

Aunque existen pocas pruebas de la afectación neurológica por el VSV durante la infección natural, los animales (por ejemplo, primates, roedores, animales de rebaño) a los que se inoculan por vía intracerebral (y en el caso de los roedores, intranasal) con el virus salvaje, el virus salvaje que ha pasado por cerebro de ratón o cultivo celular adaptado al virus salvaje, pueden desarrollar signos clónicos de la enfermedad y normalmente mueren de dos a ocho días después de la inoculación. Debido a estas observaciones y a la necesidad de producir un vector para composiciones inmunogénicas para usar en seres humanos que tenga un perfil de seguridad excepcional, los vectores del VSV en desarrollo se analizan en modelos rigurosos de neurovirulencia en primates y animales pequeños. Estas pruebas están diseñadas para detectar cualquier virulencia residual en vectores del VSV atenuado antes de considerarlos para avanzar a ensayos clínicos humanos.

La atenuación de los vectores de VSV prototipos fue el resultado de la acumulación de múltiples sustituciones de nucleótidos a lo largo del genoma del virus durante el pase en serie in vitro y la síntesis y ensamblaje del ADNc del genoma. Estas mutaciones tenían efectos pleiotrópicos que hicieron al virus menos patogénicos en ratones que en los virus adaptados de laboratorio del que se obtuvo (por ejemplo, véase Roberts y col., 1998). También se desarrollaron otros vectores de VSV atenuados mediante truncamiento de la región de cola citoplasmática de la proteína G del virus, lo que conduce a mutantes del VSV que eran defectuosos en la formación de yemas en la membrana plasmática de células infectadas (Schnell y col., 1998).

La solicitud de patente internacional publicada WO 98/5529 describe mutantes del VSV que se han atenuado mediante barajado génico (reordenamiento del orden de los genes), incluyendo el cambio de sitio del gen N a una posición más distal en 5 en el genoma.

Flanagan y col., "Gene Rearrangement Alters the Neuropathogenesis of VSV", J. Virol., 77(1):574 - 5748, 23, describe la atenuación del VSV cambiando de sitio el gen N a una posición más distal en 5 en el genoma y tiene como resultado la eliminación rápida del virus cuando se introduce en los cerebros de ratones, de modo que produce poca o ninguna neuropatogenia.

Roberts y col., "Vaccination with a Recombinant Vesicular Stomatitis Virus Expressing an Influenza Virus Hemagglutinin Provides Complete Protection from Influenza Virus Challenge", J. Virol., 73:3723 - 3732, 1999, describe la construcción de un VSV con un truncamiento del dominio citoplasmático de la proteína G y la inserción el

gen que expresa la HA de la gripe. El VSV se atenuó y proporcionó a los ratones protección frente a la exposición al virus letal de la gripe.

Los vectores del VSV conocidos en la actualidad, supuestamente atenuados o no, han tenido niveles inaceptables de virulencia relativa cuando se analizan en modelos de neurovirulencia animales y primates no humanos. El desarrollo de un vector del VSV para usos tales como un vector para composiciones inmunogénicas, un vector de terapia génica y similares, requerirá vectores del VSV que tienen niveles mínimos o no detectables de patogenicidad en modelos de neurovirulencia animal. Por tanto, actualmente existe la necesidad en la técnica de vectores virales para identificar mutantes del VSV atenuados modificados genéticamente que tienen una patogenicidad significativamente reducida (o eliminada) en mamíferos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere en sentido amplio a la atenuación sinérgica del virus de la estomatitis vesicular (VSV). Más particularmente, la invención se refiere a la identificación de clases de mutación combinadas que atenúan sinérgicamente la patogenicidad de los vectores del VSV en mamíferos y composiciones inmunogénicas de los mismos.

Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la invención está dirigida a un VSV modificado genéticamente que comprende al menos dos clases diferentes de mutaciones en su genoma, en el que las dos mutaciones atenúan de forma sinérgica la patogenicidad del VSV. En una realización particular, la patogenicidad del VSV se define además como neurovirulencia. En otra realización, las clases de mutaciones son una mutación sensible a la temperatura (ts), una mutación puntual, una mutación de barajado génico de N, una mutación no citopática en el gen M, una mutación en el ARN ambisentido, una mutación del gen G truncado, una mutación por inserción del gen G y una mutación génica por deleción.

En una realización particular, las dos mutaciones del VSV son una mutación del gen G truncado (en lo sucesivo, "G(ct)") y una mutación por barajado génico de N (es decir, el gen N se aleja de su primera posición proximal al promotor en 3 salvaje a una posición más distal en el orden de los genes del VSV). En otra realización, la proteína G del VSV codificada por el gen truncado G tiene una deleción en los últimos veinte aminoácidos en el extremo carboxi (en lo sucesivo, "G^g)"). En otra realización más, la proteína G del VSV codificada por el gen truncado G tiene una deleción en los últimos veintiocho aminoácidos en el extremo carboxi (en lo sucesivo, "G(ct-i)"). En otra realización más, el gen N del VSV se baraja a 3'-PNMGL-5' o 3'-PMNGL-5' con respecto al 3'-NPMGL-5' en el genoma del VSV salvaje, en el que N es el gen que codifica la proteína de la nucleocápside, P es el gen que codifica la fosfoproteína, M es el gen que codifica la proteína de la matriz, G es el gen que codifica la glicoproteína de unión y L es el gen que codifica la proteína ARN polimerasa dependiente de ARN. En ciertas realizaciones, el VSV comprende un genoma mutado de 3'-PNMG(ct-i)L-5', 3'-PNMG(Ct-9)L-5', 3'-PMNG(Ct-i)L-5' o 3'-PMNG(Ct-9)L-5', en el que N es el gen que... [Seguir leyendo]

1. Un virus de la estomatitis vesicular (VSV) modificado genéticamente que comprende dos mutaciones que son una mutación del gen G truncado en el dominio citoplasmático y una mutación por barajado del gen N, de forma que el gen N es desplazado desde su posición salvaje proximal al promotor en 3 a una posición más distal en el orden de los genes del VSV, en el que las dos mutaciones atenúan de forma sinérgica la patogenicidad del VSV, en el que la patogenicidad se define además como neurovirulencia.

2. El VSV de la reivindicación 1, en el que la proteína G codificada por el gen G truncado tiene una deleción de los últimos veinte o veintiocho aminoácidos en el extremo carboxi.

3. El VSV de la reivindicación 1, en el que la proteína G codificada por el gen G truncado tiene un dominio de cola citoplasmática que consiste en uno o nueve aminoácidos.

4. El VSV de la reivindicación 1, en el que el gen N se baraja a 3'-PNMGL-5' o 3'-PMNGL-5', en relación con el genoma del VSV salvaje 3'-NPMGL-5', en el que N es el gen que codifica la proteína de la nucleocápside, P es el gen que codifica la fosfoproteína, M es el gen que codifica la proteína de la matriz, G es el gen que codifica la glicoproteína de unión y L es el gen que codifica la proteína ARN polimerasa dependiente de ARN.

5. El VSV de la reivindicación 1, que comprende un genoma mutado seleccionado del grupo que consiste en 3'- PNMG(ct-i)L-5', 3'-PNMG(Ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-i)L-5' y 3'-PMNG(Ct-9)L-5', en el que N es el gen que codifica la proteína de la nucleocápside, P es el gen que codifica la fosfoproteína, M es el gen que codifica la proteína de la matriz, G(ct-i) es el gen que codifica la glicoproteína de unión que tiene una deleción de los últimos veintiocho aminoácidos en el extremo carboxi, G(ct-9) el gen que codifica la glicoproteína de unión que tiene una deleción de los últimos veinte aminoácidos en el extremo carboxi y L es el gen que codifica la proteína ARN polimerasa dependiente de ARN.

6. El VSV de la reivindicación 5, que además comprende una tercera clase de mutación en su genoma, en el que la mutación es una mutación ts, una mutación en el ARN ambisentido, una mutación no citopática en el gen M, una mutación por deleción génica, una mutación por inserción génica o una mutación puntual.

7. El VSV de la reivindicación 1, en el que el VSV cuando se inyecta por vía intracraneal en ratones Swlss-Webster hembra de 4 semanas de edad tiene una DL5 1 veces, 1. veces, 1. veces o 1. veces mayor que el VSV salvaje cuando se inyecta por vía intracraneal en ratones Swiss-Webster hembra de 4 semanas de edad.

8. Un vector del VSV modificado genéticamente que comprende un VSV modificado genéticamente que comprende dos mutaciones que son una mutación del gen G truncado en el dominio citoplasmático y una mutación por barajado del gen N, de forma que el gen N es desplazado desde su posición salvaje proximal al promotor en 3 a una posición más distal en el orden de los genes del VSV, en el que las dos mutaciones atenúan de forma sinérgica la patogenicidad del VSV, en el que la patogenicidad se define además como neurovirulencia y que comprende adicionalmente al menos una secuencia de ARN extraño insertada en, o sustituyendo a, una región del genoma del VSV no esencial para la replicación.

9. El vector de la reivindicación 8, en el que el ARN extraño se define además como un marco de lectura abierto (ORF).

1. El vector de la reivindicación 8, en el que el ARN extraño es seleccionado del grupo que consiste en un gen del VIH, un gen del HTLV, un gen del SIV, un gen del RSV, un gen del PIV, un gen del HSV, un gen del CMV, un gen del virus de Epstein-Barr, un gen del virus de varicela zóster, un gen del virus de la parotiditis, un gen del virus del sarampión, un gen del virus de la gripe, un gen del poliovirus, un gen del rhinovirus, un gen del virus de la hepatitis A, un gen del virus de la hepatitis B, un gen del virus de la hepatitis C, un gen del virus Norwalk, un gen del togavirus, un gen del alfavirus, un gen del virus de la rubéola, un gen del virus de la rabia, un gen del virus Marburg, un gen del virus ébola, un gen del virus del papiloma, un gen del virus del polioma, un gen del metapneumovirus, un gen del coronavirus, un gen de Vibrio cholerae, un gen de Streptococcus pneumoniae, un gen de Streptococcus pyogenes, un gen de Helicobacter pylori, un gen de Streptococcus agalactiae, un gen de Neissería meningitidis, un gen de Neissería gonorrheae, un gen de Corynebactería diphtheria, un gen de Clostridium tetani, un gen de Bordetella pertussis, un gen de Haemophilus, un gen de Chlamydia, un gen de Escherichia coli, un gen que codifica una citocina, un gen que codifica un epítopo de los linfocitos T colaboradores, un gen que codifica un epítopo de CTL, un gen que codifica un adyuvante y un gen que codifica un cofactor.

11. El vector de la reivindicación 1, en el que el gen del VIH es seleccionado del grupo que consiste en gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev y vpu.

12. Una composición inmunogénica que comprende una dosis inmunogénica de un vector del VSV modificado genéticamente de la reivindicación 8.

13. Uso de una dosis inmunogénica del vector del VSV de la reivindicación 8 en la preparación de un medicamento para inmunizar un huésped de mamífero contra la infección bacteriana, en el que la secuencia de ARN extraño codifica una proteína bacteriana seleccionada del grupo que consiste en una proteína de Vibrio cholerae, una proteína de Streptococcus pneumoniae, una proteína de Streptococcus pyogenes, una proteína de Streptococcus

agalactiae, una proteína de Helicobacter pylorí, una proteína de Neissería meningitidis, una proteína de Neisseria gonorrheae, una proteína de Corynebactería diphtheríae, una proteína de Clostridium tetani, una proteína de Bordetella pertussis, una proteína de Haemophilus, una proteína de Chlamydia y una proteína de Escherichia coli.

14. Uso de una dosis inmunogénica del vector del VSV de la reivindicación 8 en la preparación de un medicamento 5 para inmunizar un huésped de mamífero contra la infección viral en el que la secuencia de ARN extraño codifica una proteína viral seleccionada del grupo que consiste en una proteína del VIH, una proteína del HTLV, una proteína del SIV, una proteína del RSV, una proteína del PIV, una proteína del HSV, una proteína del CMV, una proteína del virus de Epsteln-Barr, una proteína del virus de varicela-zóster, una proteína del virus de la parotiditis, una proteína del virus del sarampión, una proteína del virus de la gripe, una proteína del poliovirus, una proteína del rhinovirus, 1 una proteína del virus de la hepatitis A, una proteína del virus de la hepatitis B, una proteína del virus de la hepatitis C, una proteína del virus Norwalk, una proteína del togavlrus, una proteína del alfavirus, una proteína del virus de la rubéola, una proteína del virus de la rabia, una proteína del virus Marburg, una proteína del virus ébola, una proteína del virus del papiloma, una proteína del virus del polioma, una proteína del metapneumovirus y una proteína del coronavirus.