Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido N-glicolil-GM3 y su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores.

La presente invención se relaciona fundamentalmente con la producción de inmunoglobulinas menos inmunogénicas por la vía de la ingeniería genética,

y mas específicamente con un anticuerpo monoclonal que reconoce antígenos que contienen el gangliósido N-glicolil GM3 y no otros gangliósidos del tipo N-glicolil o N-acetil, ni a los glicolípidos sulfatados. Mas específicamente la presente invención se relaciona con las secuencias peptídicas que codifican un anticuerpo monoclonal recombinante contra el ganliósido n-glicolil GM3, o fragmentos derivados del mismo y composiciones farmacéuticas conteniendo dicho anticuerpo o sus fragmentos y su uso tanto diagnostico o terapéutico en cáncer de mama y melanoma.

Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido N-glicolil-GM3 y su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores

Campo técnico.

La presente invención se refiere al campo de la inmunología y, en particular, a la obtención inmunoglobulinas menos inmunogénicas utilizando la tecnología de ingeniería genética para su uso en el tratamiento del cáncer. La presente invención está relacionada específicamente con las secuencias de péptidos que codifican un anticuerpo monoclonal o fragmentos derivados que reconocen antígenos que contienen el gangliósido N-glicolil GM3 y no otros gangllósldos relacionados como N-glicolilo o N-acetilo, y ni glicolípldos sulfato.

Antecedentes de la invención.

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y están presentes en las membranas plasmáticas de los vertebrados (Stults CLM et al., Methods Enzymology 179:167-214, 1989). Algunas de estas moléculas ha sido referidas en la literatura como antígenos asociados a tumores o marcadores tumorales (Hakamori SH: CurrOpin Immunol 3:646-653, 1991), a continuación se ha descrito el uso de anticuerpos anti-gangliósidos en el diagnóstico y la terapia del cáncer. (Hougton AN et. al, ÑAS USA 82:1242-1246, 1985; Zhang S et al. Int J Cáncer 73:42-49, 1997). Los ácidos siálicos más comunes en células de los mamíferos son N-acetilo (NAc) y N-glicolilo (NGc) (Corfield AP et al., Cell Biol Monogr 1:5-5, 1982). Generalmente el NGc no se expresa en tejidos normales humanos y de pollo, pero se distribuye ampliamente en otros vertebrados (Leeden RW et al., Biological Role of Sialic Acld. Rosemberg A y Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, Nueva York, 1-48, 1976, Kawai T et al., Cáncer Research 51:1242-1246, 21). Sin embargo los informes de la bibliografía demuestran que los anticuerpos anti-NGc reconocen algunos tumores humanos y líneas de células tumorales (Higashi H et. al, Jpn J. Cáncer Res. 79: 952- 956, 1988, Fukul Y et al., Biochem Biophys Res Commun 16:1149-1154, 1989). Se ha encontrado un incremento en el nivel de gangliósido GM3 (NGc) en cáncer de mama humano (Marquina G et al., Cáncer Research 56:5165- 5171, 1996), que hace muy atractivo el uso de esta molécula como diana para la terapia contra el cáncer. La patente presentada EP 972782 Á1 describe el anticuerpo monoclonal murino producido por el hibridoma depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest bajo el número de acceso ECACC 981191. Este anticuerpo monoclonal tiene un isotipo lgG1 y fue generado mediante la inmunización de ratones Balb/c con el gangliósido NGcGM3 conjugado hidrófobamente con lipoproteínas de baja densidad (VLDL) y en presencia de coadyuvante de Freund, dicho anticuerpo se une preferentemente al gangliósido NGcGM3 y reconoce un antígeno expresado en tumores de mama y melanoma humanos. (Carr A et al., Hybridoma 19:3:241-247, 2). Este anticuerpo mostró una fuerte actividad citolítica sobre las células portadoras de dicha secuencia, una propiedad que podría convertirlo en una herramienta terapéutica.

Por otra parte se sabe que la neovascularización inducida por los tumores constituye uno de los principales parámetros en el control del crecimiento tumoral. Esto orienta la investigación hacia la búsqueda de nuevas armas terapéuticas relacionadas con la inhibición del proceso antigénico. Existen evidencias experimentales del efecto del anticuerpo 14F7 relacionado con este proceso. Dichas evidencias se han encontrado en el análisis del gel de la matriz (Angiogenesis. Vol. 4, págs. 113-121, 21; Anti-Cancer Res. Vol.18, Págs. 783-79, 1998). El gel de la matriz es una mezcla de proteínas de la membrana basal y la matriz extracelular que rodea las células endoteliales. Su utilidad en el proceso de neovascularización radica en la importancia fisiológica de las interacciones endotelio- matriz durante el desarrollo de los nuevos vasos sanguíneos. Del mismo modo los componentes de este gel, tales como la laminina, se consideran marcadores importantes de este proceso.

Este tipo de modelo se ha utilizado también en el estudio de los mecanismos relacionados con la angiogénesis inducida por tumores que permite evaluar los fármacos capaces de modular los eventos directamente relacionados con el tumor influyendo así en su crecimiento y metástasis.

El uso de anticuerpos monoclonales no humanos, tales como 14F7 murino tiene ciertas desventajas para el tratamiento en seres humanos, concretamente en esquemas terapéuticos repetitivos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales murinos tienen una vida media en sangre relativamente corta. Adicionalmente pierden importantes propiedades inmunológicas, tales como las funciones efectoras cuando se utilizan en seres humanos.

Y lo qué podría ser de mayor importancia, los anticuerpos monoclonales murinos contienen secuencias de aminoácidos considerables que son inmunogénicas cuando se inyectan en los seres humanos. Numerosos estudios han demostrado que después de la administración de un anticuerpo foráneo la respuesta inmunitaria producida en el paciente puede ser considerablemente fuerte y eliminar sustancialmente el efecto terapéutico del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Por otra parte, incluso después de administrar el tratamiento a un paciente con un anticuerpo monoclonal murino, posteriores tratamientos con anticuerpos murinos no relacionados podrían ser ineficaces e incluso peligrosos debido a la reactividad cruzada conocida como respuesta HAMA (Khazaeli, M. B., et

al., Journal of Inmunotherapy 15: 42-52, 1994).

Mateo et. al (Patente de los Estados Unidos Núm. US 5 712 12) describen un procedimiento para la reducción de la inmunogenlcldad de los anticuerpos murinos. El anticuerpo modificado mediante el método descrito por Mateo et. al (Mateo C et al., Hybrldoma 19: 6:463-471, 2), conserva la capacidad reconocimiento y de unión al antfgeno del anticuerpo original y resulta menos inmunogénico, lo que aumenta su utilidad terapéutica. Mediante este procedimiento se obtienen, con un pequeño número de mutaciones, anticuerpos modificados que muestran una reducción de la inmunogenicidad en comparación con el anticuerpo quimérico.

De lo anterior se infiere que de las versiones obtenidas de los anticuerpos terapéuticos que son menos inmunogénicos, las obtenidas de una manera simple y económica resultan adecuadas para la fabricación de formulaciones terapéuticas para su uso en seres humanos.

También se sabe que el uso de fragmentos de anticuerpos ha sido muy útil en el inmunodiagnóstico de enfermedades. Ira Pastan entre otros (Patente Europea presentada EP 796334 A1) describe la construcción de fragmentos de cadena sencilla de tipo Fv utilizando las regiones variables de anticuerpos que reconocen específicamente los hidratos de carbono relacionados con el antígeno Y de Lewis. Basándose en dichos fragmentos el autor desarrolla un método para detectar células que portan dicho antígeno y también proporciona evidencias del efecto inhibidor que estos fragmentos tienen sobre las células que portan el antígeno.

El conocimiento del sitio de unión del anticuerpo monoclonal 14F7 resulta interesante desde el punto de vista práctico y teórico debido al potencial de este antígeno en la inmunoterapia de diversas enfermedades. Souriau, C et al., en Expert Opin. Biol. Ther. 1, 845-855, 21 y Chester, K. A., et al., en Dis. Markers. 16, 53-62, 2, demuestran que el uso de fragmentos de anticuerpos del tipo scFv podría resultar de gran utilidad terapéutica aprovechando sus propiedades farmacológicas tales como una mejor penetración en el tejido tumoral.

La construcción de mini-bibliotecas de fragmentos de anticuerpos expuestos en fagos filamentosos a partir de hibridomas permite la selección de moléculas con la capacidad de reconocimiento específico del antígeno dentro de este repertorio. El objetivo es obtener rápidamente fragmentos de anticuerpos que combinan el reconocimiento del anticuerpo original con un tamaño molecular más pequeño y la capacidad de ser producidos por anfitriones bacterianos. Esta técnica permite destacar las múltiples variantes de fragmentos de anticuerpos que son no funcionales o cuya producción es imposible en bacterias, que se obtienen durante el aislamiento y la manipulación de los genes de las regiones variables de un hibridoma mediante técnicas de clonación convencionales (Roovers, R. C. et al., Br. J. Cáncer. 78, 147-1416, 1998).

La tecnología de presentación de fragmentos de anticuerpo en fagos filamentosos ofrece una oportunidad única para acceder al sitio de unión del anticuerpo, así como para introducir modificaciones en el anticuerpo con el objetivo de mejorar su afinidad (Chames, P. et al., J. Immunol. 161, 5421-5429, 1998, Lamminmaki, U et... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado recombinante que reconoce el gangliósido NGcGM3 que comprende la región constante de la cadena pesada de lgG1 humana y la región constante de la cadena ligera Ck humana y las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 14F7 murino producido por el hibridoma con el depósito de ECACC 981191, en donde el anticuerpo monoclonal 14F7 murino comprende las secuencias de las regiones hipervariables (CDR) de las cadenas pesadas y ligeras mostradas a continuación:

CADENA PESADA

CDR1: SYWIH

CDR2: YIDPATAYTESNQKFKD CDR3: ESPRLRRGIYYYAMDY CADENA LIGERA

CDR1: RASQSISNNLH CDR2: YASQSIS CDR3: QQSNRWPLT;

y el anticuerpo monoclonal 14F7 murino comprende las secuencias de las regiones marco (FR) de las cadenas pesadas y ligeras mostradas a continuación:

CADENA PESADA

FR1: QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT FR2: WLKQRPDQGLEWIG FR3: KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR FR4: WGQGTTVTVSS CADENA LIGERA

FR1: DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC FR2: WYQQRTHESPRLLIK FR3: GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC FR4: FGAGTKLELKRA;

en donde el anticuerpo humanizado recombinante está caracterizado porque contiene la secuencia de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal 14F7 murino y una región variable de cadena ligera cuya secuencia es la siguiente:

Fr1

DIQMTQTPSSLSASLGDRVTISC

CDR1

RASQDISNYLN

Fr2

WYQQKPDGTVKLLI V CDR 2

YTSRLHS

Fr3

GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC

CDR 3

QQGNTLPPTF

Fr4

GAGTKLELK

o:

Fr1

DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITC

CDR1

RASQSISSFLN

Fr2

WYQQKPGKAPKLLI Y CDR 2

AAS N LQ S Fr3

GVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYC CDR 3

QQGYTTPLTF Fr4

GQGTKLELK

o:

Fr1

QSVVTQPPSASGGPGQSLTISC CDR 1

TGTSSDVGGYNHVS

Fr2

WYQQHPGKAPKLMIY CDR 2

DVSKRPS

Fr3

GVPHRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYYC CDR 3

SSYAGSN NLVF

Fr4

GGGTKVTVL

2. Un fragmento Fv de cadena sencilla que reconoce el gangliósido NGcGM3 derivado del anticuerpo monoclonal 14F7 murino producido por el hibridoma con el número de depósito ECACC 981191 caracterizado porque contiene la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 14F7 y una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo murino, cuya secuencia es la siguiente:

Fr1: DIQMTQTPSSLSASLGDRVTISC CDR 1: RASQDISNYLN Fr2: WYQQKPDGTVKLLIV CDR2: YTSRLHS

Fr3: GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC CDR3: QQGNTLPPTF Fr4: GAGTKLELK,

o

Fr1: DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITC CDR1: RASQSISSFLN Fr2: WYQQKPGKAPKLLIY CDR2: AASNLQS

Fr3: GVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYC CDR3: QQGYTTPLTF Fr4: GQGTKLELK,

o

Fr1: QSVVTQPPSASGGPGQSLTISC CDR1: TGTSSDVGGYNHVS Fr2: WYQQHPGKAPKLMIY CDR2: DVSKRPS

Fr3: GVPHRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYYC

CDR3: SSYAGSNNLVF Fr4: GGGTKVTVL.

3. Una línea celular que expresa el anticuerpo recomblnante o el fragmento de Fv de cadena sencilla de las 5 reivindicaciones 1 o 2.

4. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de tumores malignos que comprende el anticuerpo recombinante o el fragmento de Fv de cadena sencilla de las reivindicaciones 1 o 2, y un excipiente apropiado.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de tumores de mama y

melanomas malignos y sus metástasis y recidivas.