Anticuerpos que reconocen un epítopo que contiene carbohidratos en CD43 y ACE expresados en células cancerosas y métodos de uso de los mismos.

Un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera,

en el que

(a) la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, en la que la HCDR1 comprende SYVMH, la HCDR2 comprende YINPYNGGTQYNEKFKG y la HCDR3 comprende RTFPYYFDY; y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9, en la que la región bisagra de la región constante de cadena pesada comprende al menos una inserción, deleción o sustitución de aminoácidos; y

(b) la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, en la que la LCDR1 comprende RSSQSILHSNGNTYLE, la LCDR2 comprende KVSNRFS y la LCDR3 comprende FQGSHAPLT; y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y que adicionalmente comprende al menos una inserción de aminoácidos, en donde el anticuerpo se une a un epítopo de carbohidrato en el dominio extracelular de una CD43 humana y/o un ACE humano, expresado por una célula cancerosa no hematopoyética y que es capaz de inducir la apoptosis de la célula cancerosa no hematopoyética en ausencia de conjugación con citotoxina y de función inmunoefectora.

Anticuerpos que reconocen un epítopo que contiene carbohidratos en CD43 y ACE expresados en células cancerosas y métodos de uso de los mismos

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos n° de serie 61/014,716, presentada el 18 de diciembre del 2.007.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos y humanizados) que reconocen un epítopo que contiene carbohidratos en CD43 y en el antígeno carcinoembrionario (ACE) expresado en células tumorales o cancerosas no hematopoyéticas. Estos anticuerpos tienen la propiedad de inducir la muerte celular (por ejemplo, apoptosis) en estas células tumorales o cancerígenas no hematopoyéticas en ausencia de conjugación con citotoxinas y de función inmunoefectora. Estos anticuerpos son útiles como agentes de diagnóstico y terapéutico.

Antecedentes de la invención

La molécula CD43 (también denominada sialoforina o leucosialina), sumamente sialilada, se expresa a altos niveles en la mayoría de los leucocitos humanos, incluyendo todas las células T y plaquetas con un peso molecular que varía de 115.000 a 135.000. La expresión de CD43 es defectuosa en células T de hombres con el síndrome de Wiskott-Aldrich, un trastorno inmunodeficitario recesivo ligado al cromosoma X (Remold-ODonnell et al. (1987) Blood 70(1): 104-9; Remold-ODonnel et al. (1984) J. Exp. Med. 159:1705-23).

Estudios funcionales demostraron que el anticuerpo monoclonal anti-CD43 estimulaba la proliferación de linfocitos T de sangre periférica (Mentzer et al. (1987) J. Exp. Med. 1; 165 (5): 1383-92; Park et al., (1991) Nature, 350:706-9) y la activación de monocitos (Nong et al. (1989) J. Exp. Med. 1:170(1 ):259-67). Un anticuerpo monoclonal anti-CD43 L11, bloquea la unión de células T a nodulos linfáticos y a las HEV (vénulas de endotelio alto) de las placas de Peyer. El anticuerpo L11 inhibe el extravase de células T desde la sangre al Interior de tejidos linfoideos secundarios organizados (McEvoy et al. (1997) J. Exp. Med. 185:1493-8). Los anticuerpos monoclonales que reconocen la molécula CD43 inducen la apoptosis de células progenltoras hematopoyéticas (CPH) de médula ósea, de linaje marcador-negativo, que expresan CD43 a una alta densidad (Bazil et al. (1996) Blood, 87(4): 1272-81.) y de células T linfoblastoldeas humanas (Brown et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:27686-95). Recientes estudios indican adiclonalmente que CD43 actúa como un ligando para la E-selectina en células T humanas (Matsumoto et al. (2005) J. Immunol. 175:8042-50; Fuhlbrigge etal. (2006) Blood, 107:1421-6).

De manera interesante, los científicos también han descubierto que determinadas células tumorales no hematopoyéticas, especialmente adenocarcinomas colorrectales, expresan moléculas CD43 en la superficie celular. Santamaría et al. (1996) Cáncer Research, 56:3526-9: Baeckstrom et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:13688-92; Baeckstrom et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:11503-9; Sikut et al. (1997) Biochem. Biophy. Res. Commun. 238:612-6. Se ha demostrado que los glucanos expresados sobre CD43 en una línea de células de carcinoma de colon (COLO 205) son diferentes de los de CD43 de leucocitos (Baeckstrom et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:115 03 -9). Aunque se ha sugerido que la sobreexpresión de CD43 ocasiona la activación de la proteína supresora tumoral p53 (Kadaja et al. (2004) Oncogene 23:2523-30) y que suprime un subconjunto de genes diana de NF-kappaB, parcialmente mediante la inhibición de la actividad transcripcional de p65 (Laos et al. (2006) Int. J. Oncol. 28:695-704), aún se desconoce la evidencia directa que demuestre la función causal de CD43 en la tumorigénesis de colon. El uso del anticuerpo convencional anti-CD43 como agente terapéutico para células tumorales no hematopoyéticas no es práctico debido a su fuerte unión a células T tanto inmunitarias como tumorales. Continua habiendo una necesidad de generar anticuerpos que se unan específicamente a CD43 que se expresen en células tumorales o cancerígenas no hematopoyéticas, pero que no se unan a CD43 expresado en leucocitos u otras células de origen hematopoyético. Estos anticuerpos pueden ser útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de cáncer no hematopoyético que expresa CD43.

El ACE se expresa normalmente en varios tejidos epiteliales glandulares (tales como los tractos gastrointestinal, respiratorio, y urogenital) donde parece estar localizado en la superficie apical de las células (Hammarstrom, S. (1999) Semin. Cáncer Biol. 9, 67-81). En tumores que surgen de estos tejidos, existe un nivel creciente de expresión del ACE que se extiende desde el dominio de la membrana apical a toda la superficie celular, junto con secreción de la proteína en la sangre (Hammarstrom, S. (1999) Semin. Cáncer Biol. 9, 67-81.). La expresión excesiva del ACE se observó en muchos tipos de cánceres, incluyendo cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer mamario y cáncer tiroideo. Por lo tanto, el ACE se ha usado como un marcador tumoral y desde hace tiempo se han estado utilizando clínicamente ensayos inmunológicos para medir la cantidad elevada de ACE en la sangre de pacientes con cáncer en el pronóstico y tratamiento de cánceres (Gold P, et al. (1965) J. Expl. Med. 122:467-81; Chevinsky, A. H. (1991) Semin. Surg. Oncol. 7, 162-166; Shively, J. E. et al., (1985) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2, 355-399).

Lo que es más importante, el ACE se ha convertido en un antígeno, potencialmente útil, asociado a tumores, para la terapia dirigida (Kuroki M, et al. (2002) Anticancer Res 22:4255- 64). Se han desarrollado dos estrategias principales usando el ACE como una diana para la inmunoterapia contra el cáncer. Un método es el dlrecclonamlento específico de genes suicidas (gen de la óxido nítrico sintasa (¡NOS)) (Kuroki M. et al., (2000) Anticancer Res. 20(6A):4067-71) o ¡sotipos (Wilkinson R W. et al., (2001) PNAS USA 98, 10256-60, Goldenberg, D. M. (1991) Am. J. Gastroenterol., 86: 1392-1403, Olafsen T. et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17, 21-27, 2004) contra células tumorales que expresan el ACE mediante anticuerpos anti-ACE. Este método también se ha extendido al uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos conjugados con agentes terapéuticos, tales como fármacos, toxinas, radionucleótidos, ¡nmunomoduladores o citocinas. El otro método es utilizar actividades citolíticas ¡nmunológicas, especialmente a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) para eliminar células tumorales que expresen el ACE (Imakiire T et al., (2004) Int. J. Cáncer: 108, 564-570). Estos métodos a menudo dan lugar a liberaciones de citocina que dan como resultado efectos secundarios sistémicos.

Se han descrito anticuerpos que reconocen un epítopo que contiene carbohidratos presentes en CD43 y ACE expresados en células cancerosas no hematopoyéticas en la solicitud de patente de Estados Unidos Pub. n° 2008/0171043, Santamaría et al. (1996) Cáncer Res., 56(15): 3526-3529) y en el documento PCT WO 07/146172. Estos anticuerpos pueden inducir la apoptosis en estas células cancerosas no hematopoyéticas en ausencia de conjugación con citotoxinas y de función inmunoefectora.

Breve resumen de la invención

La invención proporciona anticuerpos como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, anticuerpos quiméricos y humanizados), que se unen específicamente a un epítopo en CD43 y/o ACE expresados por una célula cancerosa no hematopoyética, pero que no se unen específicamente a una CD43 expresada por un leucocito o por una célula Jurkat, y que son capaces de inducir la apoptosis de la célula cancerosa no hematopoyética después de la unión al epítopo expresado sobre la superficie celular de la célula cancerosa no hematopoyética en ausencia de conjugación con citotoxinas y de función inmunoefectora, en la que el epítopo comprende un carbohidrato, y la unión del anticuerpo con el epítopo se inhibe mediante un carbohidrato que comprende una estructura Lea, una Lea-lactosa, una estructura LNDFH II, o una estructura LNT. En algunas realizaciones, el epítopo al cual se unen los anticuerpos es sensible a fucosa.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos o humanizados derivados del anticuerpo murino m5F1 que tienen al menos una inserción, deleción o sustitución de aminoácido en la región bisagra de la región constante de cadena pesada.

En algunas realizaciones, la invención proporciona anticuerpos aislados que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en la que (a) la cadena pesada comprende una región variable... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que

(a) la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 1, en la que la HCDR1 comprende SYVMH, la HCDR2 comprende YINPYNGGTQYNEKFKG y la HCDR3 comprende RTFPYYFDY; y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 9, en la que la región bisagra de la región constante de cadena pesada comprende al menos una inserción, deleción o sustitución de aminoácidos; y

(b) la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, en la que la LCDR1 comprende RSSQSILHSNGNTYLE, la LCDR2 comprende KVSNRFS y la LCDR3 comprende FQGSHAPLT; y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 10 y que adicionalmente comprende al menos una inserción de aminoácidos, en donde el anticuerpo se une a un epítopo de carbohidrato en el dominio extracelular de una CD43 humana y/o un ACE humano, expresado por una célula cancerosa no hematopoyética y que es capaz de inducir la apoptosis de la célula cancerosa no hematopoyética en ausencia de conjugación con citotoxina y de función inmunoefectora.

2. Un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que

(a) la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 1, en la que la HCDR1 comprende SYVMH, la HCDR2 comprende YINPYNGGTQYNEKFKG y la HCDR3 comprende RTFPYYFDY; y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 25-30; y

(b) la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, en la que la LCDR1 comprende RSSQSI LHSNGNTYLE, la LCDR2 comprende KVSNRFS y la LCDR3 comprende FQGSHAPLT; y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 10 y 31-37,

en donde el anticuerpo se une a un epítopo de carbohidrato en el dominio extracelular de una CD43 humana y/o un ACE humano expresado por una célula cancerosa no hematopoyética y que es capaz de inducir la apoptosis de la célula cancerosa no hematopoyética en ausencia de conjugación con citotoxina y de función inmunoefectora.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o quimérico.

4. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de las SEC ID N°: 27 o 29.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que región variable de cadena pesada comprende la secuencia de

aminoácidos de los restos 20-137 de la SEC ID N°: 1 y la región constante de cadena pesada comprende la

secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 27, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 20-131 de la SEC ID N°: 2 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 10, o la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de

aminoácidos de los restos 20-137 de la SEC ID N°: 1 y la región constante de cadena pesada comprende la

secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 29, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 20-131 de la SEC ID N°: 2 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de las SEC ID N°: 34 o 35.

6. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 20-137 de la SEC ID N°: 1 y la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 29, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 20-131 de la SEC ID N°: 2 y la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 34.

7. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2 en donde el anticuerpo se conjuga con una citotoxina.

8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

9. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las

reivindicaciones 1-7.

11. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 10.

12. Un método para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11 que produce el anticuerpo codificado por el ácido nucleico y recuperar el anticuerpo del cultivo celular, o que comprende la expresión en una célula hospedadora,

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica una cadena pesada, comprende una región variable de cadena pesada que comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 1, en el que la HCDR1 comprende SYVMH, la HCDR2 comprende YINPYNGGTQYNEKFKG y la HCDR3 comprende RTFPYYFDY; y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 11-30; y

(b) un poli nucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región variable de cadena ligera que comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, en la que la LCDR1 comprende RSSQSILHSNGNTYLE, la LCDR2 comprende KVSNRFS y la LCDR3 comprende FQGSHAPLT; y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 10 y 31-37,

en donde los polinucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera se co-expresan en dicha célula hospedadora y en donde el anticuerpo se une a un epítopo de carbohidrato en el dominio extracelular de una CD43 humana y/o un ACE humano expresado por una célula cancerosa no hematopoyética y que es capaz de inducir la apoptosis de una célula cancerosa no hematopoyética en ausencia de conjugación con citotoxina y de función inmunoefectora.

13. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de cáncer no hematopoyético en un individuo que tiene cáncer, en el que el anticuerpo se une a las células cancerosas del individuo.

14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el cáncer no hematopoyético es cáncer colorrectal, pancreático o gástrico.

15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el anticuerpo está conjugado con una citotoxina.

16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en combinación con una cantidad de otro agente anticanceroso, opcionalmente un agente quimioterapéutico, y en el que el anticuerpo y el agente anticanceroso conjuntamente proporcionan un tratamiento eficaz del cáncer en el individuo.

17. Un kit que comprende una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, e instrucciones para administrar a un individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer no hematopoyético, en donde, opcionalmente, el kit también comprende instrucciones para administrar a un individuo la composición farmacéutica junto con otro agente anticanceroso para tratar cáncer no hematopoyético o una segunda composición que comprende otro agente anticanceroso.