Anticuerpos específicos para el dominio regulador C-terminal del EGFR y su uso.

Una composición que comprende una molécula de unión al dominio regulador (RD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR),

cuya unión al EGFR es inhibida competitivamente mediante un péptido aislado que se compone de los residuos de aminoácidos 1167-1185 de la SEC. ID. Nº 1 o un fragmento inmunogénico de dicho péptido, donde la molécula de unión a RD es un anticuerpo, que se une específicamente a los residuos 1167-1185 de la SEC. ID. Nº 1.

Anticuerpos específicos para el dominio regulador C-terminal del EGFR y su uso Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a moléculas de unión a antígeno, como anticuerpos, específicas para una porción del dominio intracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico («EGFR») y a los usos de estas moléculas de unión a antígeno, por ejemplo, para el pronóstico del cáncer y/o como indicadores de terapias específicas para el cáncer (por ejemplo, inhibidor del EGFR).

Antecedentes

Cáncer es el nombre genérico de un amplio abanico de enfermedades malignas que se caracterizan por el crecimiento no regulado, la falta de diferenciación y la capacidad para invadir tejidos locales y metastatizar. Estas enfermedades malignas neoplásticas afectan, con diversos grados de prevalencia, a todos los tejidos y órganos del cuerpo. Históricamente, los cánceres se han diagnosticado utilizando características clínicas e histológicas convencionales del tejido u órgano afectado. Sin embargo, ahora resulta evidente que los tumores, incluso del mismo tejido u órgano, son heterogéneos a nivel celular y/o molecular. Como consecuencia, el pronóstico y/o la sensibilidad a la terapia de cada paciente pueden ser diferentes. Esta impredecibilidad dificulta la selección del tratamiento y puede exponer a los pacientes a los riesgos y molestias de terapias innecesarias.

Los cánceres EGFR positivos ofrecen un ejemplo ilustrativo. El EGFR y sus efectores de señalización en sentido descendente, incluyendo los miembros de las vías Ras/Raf/MAP quinasas, desempeñan un papel importante en la biología de las células epiteliales tanto normales como malignas (Normanno et al., Gene, 366:2-16, 26). La amplificación y/o mutación del gen del EGFR y/o la sobreexpresión de la proteína del EGFR se han asociado con diversas enfermedades malignas, incluyendo el cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma y/o astrocitoma.

Se cree que el aumento de la actividad del EGFR (sea como resultado de una expresión de proteína anormalmente elevada, la desregulación de la actividad del receptor u otro mecanismo) contribuye a la carcinogénesis. Por consiguiente, el EGFR es un objetivo consolidado para el desarrollo de agentes

terapéuticos.

Existen diversos inhibidores del EGFR disponibles para el tratamiento clínico. Entre ellos se incluyen anticuerpos específicos para el EGFR (p. ej., cetuximab (ERBITUX) y panitumumab (VECTIBIX)) y moléculas pequeñas inhibidoras de la tirosina quinasa (p. ej., gefitinib (IRESSA) y erlotinib (TARCEVA)). A pesar de que estos tratamientos han beneficiado a subconjuntos de pacientes con cáncer, las respuestas a los fármacos son variables. Por ejemplo, tres estudios clínicos de pacientes con cáncer colorrectal avanzado que utilizaron cetuximab en monoterapia y/o combinado con irinotecan (un agente quimioterapéutico) demostraron unas tasas de respuesta del 1,5% o 1,8% en el caso del cetuximab en monoterapia y del 22,5% o 22,9% para la terapia combinada (revisado por Iqbal y Lenz, Cáncer Chemother. Pharmacol., 54(Supl. I):S32-39,

24). Del mismo modo, aproximadamente el 1% o el 2% de los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) tratados con 25 o 5 de gefitinib al día, respondieron al fármaco y presentaron una mejoría de los síntomas, respectivamente (Birnbaum y Ready, Curr. Treat. Options Oncol., 6( 1):75-81, 25).

Las respuestas de los pacientes a los inhibidores del EGFR han sido correlacionaos con diversas métricas del EGFR. Por ejemplo, la expresión de EGFR (medida por inmunohistoquímica) se asoció con una respuesta objetiva al tratamiento con erlotinib en los pacientes con NSCLC (Tsao et al., N. Engl. J. Med., 353:133-144,

25). Sin embargo, la supervivencia tras el tratamiento en estos pacientes no se vio influida por la expresión del EGFR, el número de copias de EGFR ni la mutación de EGFR (Tsao et al., N. Engl. J. Med., 353:133-144, 25). Tanto en entornos preclínicos como clínicos, se descubrió que las mutaciones somáticas en el dominio de la tirosina quinasa del EGFR estaban correlacionadas con la sensibilidad de los pacientes con NSCLC al gefitinib y erlotinib pero no al cetuximab (Janne et al., J. Clin. Oncol., 23:3227-3234, 25). Los estudios clínicos de gefitinib demostraron una asociación entre el aumento del número de copias de EGFR, el estado mutacional y la respuesta clínica en el NSCLC avanzado (Cappuzzo et al.,J. Nati. Cáncer Inst., 97:643-655, 25).

Los anticuerpos del EGFR en el uso clínico (p. ej., cetuximab (ERBITUX) y panitumumab (VECTIBIX)) se unen al dominio extracelular del EGFR. Este dominio del receptor incluye el sitio de unión del ligando y se cree que estos anticuerpos bloquean la unión del ligando, interrumpiendo así la señalización del EGFR. Como resultado de la utilidad terapéutica de estos anticuerpos del EGFR, muchos estudios posteriores se han concentrado en la producción de anticuerpos (u otras moléculas de unión) específicos para el dominio extracelular del EGFR (véanse, por ejemplo, las Patentes estadounidenses n° 5 459 61, 5 558 864, 5 891 996, 6 217 866, 6 235 883, 6 699 473 y 7 6 88; las Patentes europeas n° EP359282 y EP667165).

Menos atención se ha prestado a los anticuerpos específicos para el dominio citoplásmico del EGFR, en particular con fines terapéuticos. Sin embargo, por ejemplo, Hyland et ai propuso la expresión intracelular de

anticuerpos de cadena simple (p. ej., scFvs) como un planteamiento prometedor para la interferencia selectiva en la señalización del EGFR. Otros han descrito anticuerpos específicos para el dominio intracelular ctel EGFR al menos a efectos de detección (p. ej.,Lin et al., Cell. Mol. Immunol., 1(2): 137-141, 24; Hyland et al., Oncogene, 22(1): 1557-1567, 23, Panneerselvam et al., J. Biol. Chem.,27(14):7975-7979, 1995; Gullickef al., J. Pathol., 164(4):285-289, 1991; Dazzi et al., Anal. Cell. Pathol., 3(2):69-75, 1991), y ya se comercializan algunos anticuerpos específicos para el dominio intracelular del EGFR (p. ej., Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.), Cat. N° 192-1 y 2235-1; Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, EE.UU.), Cat. N° 445 y 2239; Spring Bioscience (Fremont, CA,EE.UU.), Cat. N° E2451).

Al menos un estudio comparó la reactividad de los anticuerpos específicos para los dominios interno y externo del EGFR en el mismo conjunto de tejidos de cáncer de pulmón (Dazzi et al., Anal. Cell. Pathol., 3(2):69-75, 1991). No se observaron diferencias significativas en la reactividad de estos anticuerpos.

El constante desarrollo clínico de terapias inhibidoras del EGFR se beneficiaría de una estrategia paralefe para la identificación de poblaciones de pacientes con muchas probabilidades de responder a estos tratamientos. Se necesitan nuevos marcadores de pronóstico y predictivos, que facilitarían una individualización de la terapia para cada paciente, al objeto de predecir de forma precisa las respuestas de los pacientes a estos tratamientos y de ayudar a los médicos a distinguir entre las opciones de tratamiento para estos pacientes.

Resumen de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

En el presente se divulgan métodos para averiguar el estado de la regulación del EGFR (y, por tanto, el estado de actividad del EGFR) en muestras biológicas (tales como secciones de tejido fijadas con formalina y embebidas en parafina («FFPE»)). El estado de activación del EGFR predice, entre otras cosas, la agresividad de las neoplasias EGFR-positivas y/o la potencial eficacia de las terapias dirigidas al EGFR que dependen al menos en parte del estado de activación del EGFR. Los métodos divulgados implican el uso de moléculas de unión a antígeno (también denominadas moléculas de unión a RD) que se unen específicamente al dominio regulador intracelular del EGFR. El estado de regulación del EGFR en las células y/o tejidos neoplásicos o normales se puede diferenciar por la accesibilidad del dominio regulador del EGFR a las moléculas de unión a RD (incluyendo las moléculas de unión a RD divulgadas).

También se divulgan péptidos obtenidos del dominio regulador del EGFR (péptidos del dominio regulador o RDP) y, en particular, de la región que tiene la secuencia LDNPDYQQDFFPKEAKPNG (el péptido o la secuencia «L2G»; SEC. ID. N°: 2). Los RDP son útiles, al menos, en la producción de ejemplos de moléculas de unión a RD y para otros fines que se revelan en la presente divulgación. En algunos ejemplos, las moléculas de unión a RD, como los anticuerpos, reconocen específicamente un epitopo incluido en una secuencia de RDP, por ejemplo, dentro... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una molécula de unión al dominio regulador (RD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), cuya unión al EGFR es inhibida competitivamente mediante un péptido aislado que se compone de los residuos de aminoácidos 1167-1185 de la SEC. ID. N° 1 o un fragmento ¡nmunogénico de dicho péptido, donde la molécula de unión a RD es un anticuerpo, que se une específicamente a los residuos 1167-1185 de la SEC. ID. N° 1.

2. Una composición conforme a la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a un péptido que se compone de los residuos de aminoácidos 1167-1185 de la SEC. ID. N° 1 o un fragmento ¡nmunogénico de dicho péptido.

3. Una composición conforme a la reivindicación 2, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. Una composición conforme a la reivindicación 3, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal de conejo.

5. Un método no terapéutico de producir un anticuerpo específico para el EGFR que se une específicamente a los residuos 1167-1185 de la SEC. ID. N° 1, que consiste en la inmunización de un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende una proteína portadora y un péptido que se compone de los residuos de aminoácidos 1167-1185 de la SEC. ID. N° 1 o un fragmento ¡nmunogénico de dicho péptido.

6. Un método conforme a la reivindicación 5 que comprende también el aislamiento del suero del mamífero no humano y el aislamiento del anticuerpo policlonal específico para el inmunógeno.

7. Un método conforme a la reivindicación 5 que comprende también la fusión de las células del bazo de animales no humanos con un elemento asociado de la célula de fusión para obtener hibridomas que producen anticuerpos.

8. Un método de inmunotinción que consiste en poner en contacto una muestra biológica, que contiene una o más células, con la composición de la reivindicación 1 y detectar la unión específica del anticuerpo de la composición con un antígeno de la célula o células.

9. Un método conforme a la reivindicación 8, donde el antígeno es EGFR.

1. El método de la reivindicación 8 o 9, donde la muestra biológica se monta sobre el portaobjetos de un microscopio.

11. Un método conforme a la reivindicación 1, donde la muestra biológica es una sección de tejido, particularmente donde la muestra de tejido es un tejido neoplásico.

12. Un método conforme a la reivindicación 11, donde el tejido neoplásico es un cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico o glioblastoma.

13. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la sección de tejido está fijada con formalina y embebida en parafina.

14. Un método conforme a la reivindicación 8, para predecir la respuesta de una neoplasia, que se caracteriza por la expresión del EGFR, a un inhibidor del EGFR. Este método consiste en:

detectar en una muestra biológica, que comprende una o más células neoplásicas, la unión específica del anticuerpo de la composición de la reivindicación 1 a una o más de las células neoplásicas;

donde la unión específica del anticuerpo a una o más de las células neoplásicas indica que las células neoplásicas responderán a un inhibidor del EGFR.

15. Un método conforme a la reivindicación 14, donde la respuesta de la célula neoplásica es una ralentización del crecimiento.

16. Un método conforme a la reivindicación 15, donde el crecimiento ralentizado es un crecimiento cero neto o un crecimiento negativo neto, o donde el crecimiento ralentizado es al menos un 1% inferior al crecimiento de las células neoplásicas previo al tratamiento con el inhibidor del EGFR.

17. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la respuesta de la célula neoplásica es la apoptosis.

18. Un método conforme a la reivindicación 17, donde al menos el 1% de las células neoplásicas es objeto de apoptosis.

19. Un método conforme a la reivindicación 8 para predecir si un candidato para el tratamiento con un inhibidor del EGFR es probable que responda a este tratamiento. Este método consiste en:

detectar en una muestra biológica de un candidato para el tratamiento con un inhibidor del EGFR, cuya muestra biológica comprende una o más células neoplásicas, la unión específica del anticuerpo de la composición de la reivindicación 1 a una o más de las células neoplásicas;

donde la unión específica del anticuerpo a una o más de las células neoplásicas indica que es probable que el candidato responda al tratamiento con un inhibidor del EGFR.

2. Un método conforme a la reivindicación 19, donde la unión específica del anticuerpo al menos a un 1% de las células neoplásicas de la muestra biológica indica que es probable que el candidato responda al tratamiento con un inhibidor del EGFR.

21. Un método conforme a la reivindicación 8 para predecir la respuesta de una neoplasia, que se caracteriza por la expresión del EGFR, a un inhibidor del EGFR, que consiste en:

detectar en una muestra biológica que comprende una o más células neoplásicas EGFR positivas la ausencia de una unión específica del anticuerpo de la composición de la reivindicación 1 con una o más de las células neoplásicas EGFR positivas;

donde la ausencia de una unión específica del anticuerpo a las células neoplásicas EGFR positivas indica que las células neoplásicas no presentarán una respuesta sustancial a un inhibidor del EGFR.

22. Un método conforme a la reivindicación 21, que comprende asimismo la detección en la muestra biológica de la unión específica de un segundo anticuerpo específico para el dominio externo del EGFR.

23. Un método conforme a la reivindicación 21, que comprende asimismo la detección en un material biológico de control de la unión específica del anticuerpo al EGFR.

24. El método conforme a la reivindicación 23, donde el material biológico de control es piel normal, testículos normales o amígdalas normales.

25. Un método conforme a la reivindicación 8 para predecir el pronóstico de una enfermedad neoplásica, que se caracteriza por la expresión del EGFR, y que consiste en lo siguiente:

detectar en una muestra biológica de un paciente que padece una enfermedad neoplásica la unión específica del anticuerpo de la composición de la reivindicación 1 con una o más células neoplásicas EGFR positivas en la muestra biológica;

donde la unión específica del anticuerpo de la célula o células neoplásicas EGFR positivas predice un mal pronóstico de la enfermedad neoplásica del paciente.

26. Un método conforme a la reivindicación 25, donde el anticuerpo se une específicamente al menos a un 1% de las células neoplásicas EGFR positivas de la muestra biológica.

27. Un método conforme a la reivindicación 26, donde el anticuerpo se une específicamente al menos a un 5 % de las células neoplásicas EGFR positivas de la muestra biológica.

28. Un método conforme a la reivindicación 25, donde un mal pronóstico es una supervivencia del paciente inferiora cinco años tras el diagnóstico inicial de la enfermedad neoplásica.

29. Un método conforme a la reivindicación 28, donde un mal pronóstico es una supervivencia del paciente inferiora dos años tras el diagnóstico inicial de la enfermedad neoplásica.

3. Un método conforme a la reivindicación 8 para predecir el pronóstico de una enfermedad neoplásica, que se caracteriza por la expresión del EGFR, y que consiste en:

detectar en una muestra biológica de un paciente que padece una enfermedad neoplásica la unión específica del anticuerpo de la composición de la reivindicación 1 con una o más células neoplásicas EGFR positivas en la muestra biológica;

donde la ausencia de una unión específica del anticuerpo de una o más de las células neoplásicas EGFR positivas predice un buen pronóstico de la enfermedad neoplásica del paciente.

31. Un método conforme a la reivindicación 3, donde un buen pronóstico es una supervivencia del paciente superior a cinco años tras el diagnóstico inicial de la enfermedad neoplásica.

32. Un método conforme a la reivindicación 31, donde un buen pronóstico es una supervivencia del paciente superior a dos años tras el diagnóstico inicial de la enfermedad neoplásica.

33. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, donde la enfermedad es cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico o glioblastoma.

34. Un método conforme a la reivindicación 8 para detectar una interacción directa entre el EGFR y una proteína reguladora del EGFR, que consiste en lo siguiente:

poner en contacto una muestra biológica, que comprende una o más células EGFR positivas, con la composición de la reivindicación 1 y detectar la unión específica del anticuerpo de la composición a una o más células EGFR positivas, donde la unión específica del anticuerpo a una o más células EGFR positivas detecta que el EGFR no está interactuando con una proteína reguladora del EGFR, donde una interacción entre el EGFR y la proteína reguladora del EGFR enmascara el epitopo del anticuerpo.

donde la proteína reguladora del EGFR es una proteína SOCS.

35. Un método conforme a la reivindicación 8 para detectar una Interacción directa entre el EGFR y una proteína reguladora del EGFR, que consiste en lo siguiente:

poner en contacto una muestra biológica, que comprende una o más células EGFR positivas, con la composición de 5 la reivindicación 1 y detectar la unión específica del anticuerpo de la composición a una o más células EGFR positivas, donde la ausencia de unión específica del anticuerpo a una o más células EGFR positivas detecta que el EGFR está interactuando con una proteína reguladora del EGFR, donde una interacción entre el EGFR y la proteína reguladora del EGFR enmascara el epitopo del anticuerpo.

donde la proteína reguladora del EGFR es una proteína SOCS.

36. El método de la reivindicación 34 o 35 donde la proteína SOCS es SOCS1 o SOCS3.