Anticuerpo monoclonal 9G2 específico anti-exospora Nosema apis para el diagnóstico mediante técnicas inmunoquímicas de las nosemosis de la abeja.

Anticuerpo monoclonal 9G2 especifico anti-exospora, seleccionado y caracterizado por su capacidad de reconocer epítopos presentes en la exospora de microsporidios de la especie Nosema apis,

con el fin de ser utilizado en el diagnóstico diferencial mediante técnicas inmunoquímicas, en particular la de inmunofluorescencia indirecta (IFI), en el diagnóstico de las nosemosis de la abeja causada por Nosema apis, también conocida como nosemosis o diarrea de la abeja. AcMc 9G2 puede ser aplicado, solo o en combinación con otros agentes, en la preparación de composiciones y en sistemas de detección comerciales para el diagnóstico de dicha enfermedad de las abejas.

Anticuerpo monoclonal 9G2 específico anti-exospora Nosema apis para el diagnóstico mediante técnicas inmunoquímicas de las nosemosis de la abeja.-

El objeto de la presente invención es el anticuerpo monoclonal (AcMc) 9G2 específico anti- exospora, para ser utilizado mediante técnicas inmunoquímicas, en particular la de inmunofluorescencia indirecta (IFI), en el diagnóstico de las nosemosis de la abeja causada por Nosema apis, también conocida como nosemosis o diarrea de la abeja.

El desarrollo de este AcMc específico anti-exospora frente a la especie de microsporidio objeto de estudio, Nosema apis, para su uso mediante técnicas inmunoquímicas, se presenta como una buena alternativa con respecto a las actuales técnicas basadas en marcadores moleculares, como PCR y Multiplex PCR, muy laboriosas y costosas, ya que ofrece la misma eficacia en la detección y diferenciación de las esporas de las dos especies de microsporidios del género Nosema relacionadas con dicha patología de las abejas, Nosema Apis, propia de la abeja europea Apis mellifera, y Nosema cerenae, propia de la abeja asiática Apis cerenae.

CAMPO TÉCNICO.-

El campo técnico de la invención es el de las Inmunoglobulinas, dentro de los anticuerpos monoclonales frente a patógenos parásitos, y en particular, el de investigación y desarrollo de anticuerpos monoclonales para su utilización mediante técnicas inmunoquímicas contra los microsporidios más frecuentes de las abejas.

ESTADO DE LA TÉCNICA.-

La importancia económica de la industria apícola es indiscutible ya que, las abejas son insectos polinizadores que cumplen un papel muy importante en la naturaleza. El proceso de polinización es crítico en la producción de alimentos y por lo tanto, para la continuación del modo de subsistencia humana. Es más, la polinización es un proceso que une directamente los ecosistemas naturales con los sistemas de producción agrícola (FAO, 2008; Gisder y col., 2010; Klein y col., 2007). El papel de estos insectos ha hecho que, en la actualidad, exista un elevado interés por la reciente disminución de polinizadores detectada en distintas

regiones del mundo (FAO, 2008; Williams, 2005).

En los últimos años, se ha observado una elevada mortalidad en las abejas de diferentes zonas geográficas y en consecuencia una reducción en la producción de miel (Chauzat y col., 2004; Faucon, 2005). Los análisis realizados sobre estas abejas han mostrado un incremento en los casos diagnosticados de nosemosis. La nosemosis es una patología descrita en las abejas productoras de miel producida por organismos intracelulares, concretamente, microsporidios pertenecientes al género Nosema. Existen dos especies pertenecientes a este género relacionadas con esta patología: Nosema apis parásito de las abejas occidentales y europeas, Apis mellifera, y Nosema ceranae parásito de la abeja asiática Apis ceranae. Sin embargo, el hecho de que en los últimos años, en las diferentes zonas apícolas, tanto en nuestro país como en otras regiones geográficas, se haya detectado un aumento de las infecciones por N. ceranae en la abeja occidental y europea A. mellifera, lo que ha provocado una patología mucho más agresiva a las abejas productoras de miel, hace necesaria la diferenciación de las dos especies (Faucon, 2005; Higes y col., 2004; Higes y col., 2005; Martín y col., 2005).

La patología producida por N. apis es más fácilmente detectable en las colonias. Se caracteriza por la presencia de desórdenes digestivos en los adultos (diarrea) unidos a una elevada mortalidad. En el caso de N. ceranae la sintomatología es más difícil de detectar, consistiendo, inicialmente en un descenso en el crecimiento de la colonia. Esta patología se encuentra incluida dentro de las posibles causantes del Síndrome de Despoblamiento de las Colmenas (Higes y col., 2008; Higes y col., 2006; Higes y col., 2004; Higes y col., 2005). En ambos casos, las esporas se diseminan a través de las heces y del polen siendo solo los adultos susceptibles y no exhibiendo de forma individual ningún signo externo de infección. Ello hace que la identificación rápida a nivel de especie sea un objetivo prioritario para los apicultores.

La diferenciación entre las esporas de N. ceranae y las de N. apis mediante microscopía óptica resulta bastante complicada, ya que las esporas de las dos especies de Nosema son muy similares y difícilmente diferenciables. Aunque las esporas de N. ceranae son de un tamaño ligeramente menor (4,7 x 2,7 pm) que las de N. apis (6x3 pm) (Fríes y col., 1996), si se comparan los rangos de tamaño que se han descrito para las esporas de ambas especies, existe un pequeño solapamiento, por lo que las esporas más pequeñas de N. apis podrían confundirse con las más grandes de N. ceranae. Otra característica que se puede tener en cuenta a la hora de diferenciar estas especies mediante microscopía óptica es que las esporas de N. ceranae, en algunos casos, se presentan ligeramente dobladas, lo que les proporciona una apariencia menos consistente que las de N. apis (Fries y col., 2006).

Para una mejor diferenciación entre las infecciones de las dos especies, se aconseja la utilización de cortes histológicos en los que se puede apreciar cómo se distribuyen éstas en las células del ventrículo recién infectado. Es típico de las infecciones por N. apis que las células epiteliales de A. mellifera en las que se encuentran las esporas maduras estén rodeadas de células vegetativas (merozoitos) del parásito. Probablemente esto sea el resultado de la germinación intracelular de las esporas y la subsiguiente transmisión horizontal entre células epiteliales vecinas (Fries, 1989). Las infecciones por N. ceranae en su hospedador original A. cerana, se presentan como focos aislados, de una sola célula epitelial en cuyo interior también se encuentran las esporas maduras que se han desarrollado. Esto, y el hecho de que no se encuentren esporas vacías en las células infectadas, hace pensar que esta especie no ha desarrollado la capacidad de transmisión horizontal entre células (Fries y col., 1996). Sin embargo, cuando N. ceranae infecta A. mellifera, presenta un patrón similar al de N. apis en éste hospedador, lo que descarta la histología como una técnica que permita el diagnóstico diferencial de las dos especies (Higes y col., 2007).

Las mayores diferencias entre las dos especies de Nosema aparecen al estudiar la ultraestructura de sus esporas. El túbulo polar en N. apis es de mayor tamaño, con 26-32 vueltas (Fries, 1989) que el de N. ceranae que sólo presenta 20-23 (Fries y col., 1996).

En ausencia de unas características morfológicas externas claras que permitan el reconocimiento de las dos especies utilizando el microscopio óptico de campo claro, ha hecho que se desarrollen otras técnicas, como las técnicas de biología molecular, basadas en marcadores moleculares, como PCR y Multiplex PCR (Martin-Hernandez y col., 2007) altamente sensibles que permiten la detección y diferenciación en paralelo de ambas especies.

La técnica de PCR, al ser de gran sensibilidad permite la detección de niveles muy bajos de infección producida por el parásito en todos los estados del ciclo (Weiss Vossbrinck, 1999) y la secuenciación de sus productos permite la identificación y diferenciación de las dos especies de Nosema (Higes y col., 2006). Un marcador que se ha utilizado para el diagnóstico de microporidios es la subunidad pequeña (SSU) del ARN ribosomal (16S rRNA). En estos parásitos, las secuencias de los genes de la 16S rARN son más cortas y no comparten apenas homologías con las de otros eucariotas. Además, son secuencias altamente conservadas. Muchas de estas secuencias se encuentran disponibles en la base de datos del Gene Bank. Klee y col. han desarrollado un método basado en el análisis de

polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP-PCR) de la SSU rRNA con el que se puede distinguir entre N. apis y N. ceranae (Klee y col., 2007). Martín-Hernández y col. a su vez han diseñado una PCR doble o múltiple que permite el diagnóstico simultáneo de las dos especies en la misma reacción (Martin-Hernandez y col., 2007). Chen y col. han ido más lejos poniendo a punto una PCR múltiple y a la vez cuantitativa en tiempo real (Q- PCR) lo que no sólo permite la detección simultánea de las dos especies sino la cuantificación de las mismas (Chen y col., 2009).

Sin embargo, estas técnicas de biología molecular no están exentas de complicaciones, al resultar laboriosas, con un gran número de horas necesarias para su desarrollo, y suponer un coste elevado, por requerir equipamiento y reactivos caros. Por todo ello, resulta de especial interés la búsqueda de una alternativa más económica y... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal 9G2 especifico anti-exospora, producido en hibridoma de ratón de la cepa BALB/c, seleccionado y caracterizado por su capacidad de reconocer epítopos presentes en la exospora de microsporidios de la especie Nosema apis.

2. Uso del anticuerpo monoclonal 9G2, según reivindicación 1, solo o en combinación con otros agentes, en la preparación de composiciones y sistemas de detección comerciales para el diagnóstico diferencial mediante técnicas inmunoquímicas de las nosemosis de la abeja causada por Nosema apis.

3. Uso del anticuerpo monoclonal 9G2 en el diagnóstico diferencial de las nosemosis de la abeja causada por Nosema apis, según reivindicación 2, donde las técnicas inmunoquímicas de aplicación del anticuerpo monoclonal serían las de inmunofluorescencia, indirecta (IFI) y directa (IFD), inmunoenzimáticas (ELISA) e inmunoelectrotransferencia (Western-Blot), cultivo celular y microscopía electrónica de transmisión (MET)

4. Composiciones farmacéuticas o veterinarias cuyo agente o principio reactivo es el anticuerpo monoclonal 9G2, según reivindicaciones anteriores, utilizables en cualquier técnica inmunoquímica y muestra biológica en el diagnóstico de las nosemosis de la abeja causada por Nosema apis.