Alfa-amilasa.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa que comprende:

(a) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en los aminoácidos 34 a 719 de SEC ID Nº: 2; o

(b) una secuencia de polinucleótido como se expone en los nucleótidos 100 a 2157 de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; o

(c) una secuencia de polinucleótido como se expone en SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3.

Alfa-amilasa Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva alfa-amilasa, a un proceso para su preparación y al uso de la amilasa.

La Invención se refiere a una secuencia de polinucleótldo recientemente identificada que comprende un gen que codifica la nueva enzima alfa-amilasa. La invención proporciona la secuencia de codificación de longitud completa del nuevo gen así como la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud completa del gen. La invención también se refiere a métodos de uso de estas proteínas en procesos industriales, por ejemplo en la industria alimentaria, tal como la industria de panadería. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótldo de acuerdo con la Invención adecuadas para producir estas proteínas y células. La invención se refiere a un método de fabricación del pollnucleótido de acuerdo con la invención. La invención se refiere además a un método para fabricar el polipéptido de acuerdo con la invención.

Antecedentes de la invención

Los estudios sobre la rancidez del pan han Indicado que la fracción de almidón del pan recrlstallza durante el almacenamiento, causando de ese modo un aumento de la firmeza de la miga, que se puede medir como un aumento en la dureza de las rebanadas de pan.

La presente invención se refiere a una alfa-amilasa. Las alfa-amllasas se han usado en la Industria durante mucho tiempo.

Las alfa-amilasas se han proporcionado tradicionalmente mediante la Inclusión de harina de trigo o cebada malteada y proporcionan varias ventajas al panadero. La alfa-amilasa se usa para proporcionar una producción de gas y una retención de gas satisfactorias durante la fermentación de la masa y proporcionar un color de corteza satisfactorio. Esto significa que si esta enzima no se usa en cantidad suficiente, el volumen, la textura, y la apariencia del pan se ven básicamente perjudicados. La alfa-amilasa se encuentra en la naturaleza en la propia cosecha de trigo, medida rutinariamente mediante el Número de Caída de Hagberg (método 107 de ICC), y se han dado pasos para minimizar tales variaciones mediante la adición de alfa-amilasa en el molino y a través del uso de ingredientes de especialidades en panadería ya que la enzima tiene una importancia crítica.

Más recientemente, la alfa-amilasa de los cereales se ha reemplazado en gran medida por enzimas de fuentes microbianas, incluyendo fuentes fúngicas y bacterianas. Mediante el uso de la biotecnología en la selección de cepas, fermentación y procesamiento, se pueden preparar enzimas a partir de tales fuentes microbianas y esto presenta ventajas sobre la harina de malta debido a que la enzima tiene una calidad más controlada, es relativamente pura y más rentable en uso. Sin embargo, las propiedades de las alfa-amilasas, y sus efectos tecnológicos, muestran importantes diferencias. Además de tener influencia en la producción de gas, la retención de gas y el color de la corteza, la alfa amilasa puede tener relación con la vida en anaquel del producto horneado.

El almidón de la harina de trigo contiene dos fracciones principales, amilasa y amilopectina, y estas se organizan en forma de gránulos de almidón. Una proporción de estos gránulos de variedades de trigo de molienda dura se "dañan", separándose los gránulos como consecuencia de la energía de la molienda. En el proceso de horneado, los gránulos de almidón se gelatinizan; este proceso implica un hinchamiento del gránulo por la captación de agua y una pérdida de la naturaleza cristalina del gránulo; en particular, se conoce que las amilopectinas del gránulo nativo existen en forma de cristalitos y estas moléculas se disocian y pierden cristalinidad durante la gelatinización. Una vez se ha horneado el pan, la amilopectina recristaliza lentamente con el paso de los días y es esta recristalización, o retrogradación de almidón la que se considera la causa principal de la rancidez del pan.

Estas formas variables del almidón y su interacción con alfa-amilasa dictan el papel que tiene la enzima con respecto a la tecnología de la panadería. La alfa-amilasa de fuentes fúngicas, lo más habitualmente provenientes de especies de Aspergillus, actúa principalmente sobre el almidón dañado durante la mezcla de la masa y a través de la fermentación/prueba. La baja estabilidad térmica de la enzima significa que la enzima se Inactiva durante el horneado y críticamente antes de que la gelatinización haya tenido lugar, de modo que existe poca o ninguna descomposición del almidón a partir de la fracción sin dañar. En consecuencia, la amilasa fúngica es útil en la provisión de azúcares para fermentación y color, pero prácticamente no tiene ningún valor en la prolongación de la vida en anaquel. Por otra parte, la alfa amilasa bacteriana, lo más habitualmente de Bacillus amyloliquifaciens, tiene una mayor estabilidad a la temperatura y actividad durante el horneado del pan y mientras el almidón experimenta la gelatinización. La amilasa bacteriana conduce de ese modo a una modificación en mayor extensión del almidón y, a su vez, de las calidades del pan horneado; en particular, la corteza del pan horneado puede ser sensiblemente más blanda a lo largo de la vida en anaquel y puede permitir que se aumente la vida en anaquel. Sin embargo, aunque la alfa-amilasa bacteriana puede ser útil con respecto a la prolongación de la vida en anaquel, es difícil de usar en sentido práctico ya que pequeñas sobredosis conducen a una estructura de miga inaceptable de poros grandes y

abiertos, mientras que la textura se puede volver demasiado blanda y "gomosa".

El inventor ha identificado una alfa amilasa de una fuente bacteriana particular que tiene una caída de termoestabilidad intermedia entre las alfa amilasas fúngicas y bacterianas habituales. La termoestabilidad de esta enzima es mayor que la de la alfa amilasa fúngica, permitiendo de este modo una mayor actividad en la amilopectina durante y después de la gelatinización, pero no actúa de forma tan prolongada en el proceso de horneado como las amilasas bacterianas habituales y no sobredigiere el almidón.

El documento de Patente US 4.598.048 describe la preparación de una enzima amilasa maltogénica. El documento de Patente US 4.604.355 describe una enzima amilasa maltogénica, la preparación y el uso de la misma. El documento de Patente US RE38.507 describe un proceso y un agente de antirancidez. El producto que se describe en el documento de Patente US RE38.507 se usa en la industria con el nombre comercial Novamyl®.

Se propuso encontrar un organismo capaz de producir una alfa-amilasa mejorada. En consecuencia, el inventor ha Identificado la cepa NCIMB14276 de Alicyclobacillus pohliae que ha descubierto en el Antártlco. Esta es una nueva cepa, y no se ha usado anteriormente como fuente para una alfa-amilasa que tiene propiedades mejoradas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos. La invención proporciona una nueva alfa-amilasa que se puede usar para retardar la rancidez de productos horneados tales como pan y pasteles. La invención proporciona además nuevos polinucleótidos que codifican la nueva enzima alfa-amilasa.

Por lo tanto, la Invención se refiere a:

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa que comprende:

(a) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en los aminoácidos 34 a 719 de SEC ID N°: 2; o

(b) una secuencia de polinucleótido como se expone en los nucleótldos 100 a 2157 de SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 3; o

(c) una secuencia de polinucleótido como se expone en SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 3.

La invención se refiere además a: un polipéptido de alfa-amilasa que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos como se expone en los aminoácidos 34 a 719 de SEC ID N°: 2; o

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido como se expone en los nucleótidos 100 a 2157

de SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 3.

En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de polinucleótido de acuerdo con la invención. La invención también se refiere a una célula hospedadora recomblnante que comprende el polinucleótido de acuerdo con la invención. La invención se refiere un método de fabricar el polinucleótido de acuerdo con la invención. La invención se refiere además a un método para fabricar el polipéptido de acuerdo con la Invención. La invención se refiere al uso de dicho polipéptido en la fabricación de alimentos. La invención también se refiere a una composición de enzima. La... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa que comprende:

(a) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en los aminoácidos 34 a 719 de SEC ID N°: 2; o

(b) una secuencia de polinucleótido como se expone en los nucleótidos 100 a 2157 de SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 3; o

(c) una secuencia de polinucleótido como se expone en SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 3.

2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se produce mediante NCIMB14276 de Alicyclobacillus pohliae.

3. Un vector que comprende la secuencia de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3 que es un vector de expresión, en el que la secuencia de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 está unida operativamente al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula hospedadora adecuada.

5. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la célula hospedadora adecuada es una especie de Asperglllus, Bacillus, Chrysosporlum, Escherichia, Kluyveromyces, Penicillium, Pseudomonas, Saccharomyces, Streptomyces o Talaromyces, preferentemente una especie de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Asperglllus Niger o Aspergillus oryzae.

6. Una célula hospedadora recombinante que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o que comprende el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. La célula hospedadora recomblnante de acuerdo con la reivindicación 6 capaz de expresar o sobreexpresar dicho polinucleótido o dicho vector.

8. Un método para fabricar el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que comprende las etapas de cultivar una célula hospedadora transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula hospedadora.

9. Un polipéptido alfa-amilasa que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos como se expone en los aminoácidos 34 a 719 de SEC ID N°: 2; o

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido como se expone en los nucleótidos 100 a 2157 de SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 3.

10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 obtenible por expresión del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula hospedadora apropiada.

11. Un método para fabricar el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 que comprende cultivar una célula hospedadora recomblnante de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o el vector de acuerdo con la reivindicación 3 a 5 y, opcionalmente, recuperar el polipéptido codificado de la célula o el medio de cultivo.

12. Uso del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 en la fabricación de alimentos.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12 en la fabricación de un producto horneado, preferentemente pan o pasteles.

14. Composición de enzima que comprende el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 y uno o más componentes seleccionados entre el grupo que consiste en polvo de leche, gluten, grasa granulada, una enzima adicional, un aminoácido, una sal, un oxidante tal como ácido ascórbico, bromato y azodicarbonamida, un agente reductor tal como L-cisteína, un emulgente tal como monoglicéridos, diglicéridos, monoestearato de glicerol, estearoll lactllato sódico, estearoil lactilato de calcio, ásteres de poliglicerol de ácidos grasos y DATEM, gomas tales como goma de guar y goma de xantano, aromas, ácidos tales como ácido cítrico y ácido propiónico, almidón, almidón modificado, gluten, humectantes tales como glicerol, y conservantes.

15. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la enzima adicional es una enzima lipolítica, preferentemente una fosfolipasa.

16. Método para preparar una masa que comprende la etapa de combinar el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 o la composición de acuerdo con la reivindicación 14 o 15 y al menos un ingrediente de masa.

17. Una masa que comprende el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 o la composición de acuerdo con la reivindicación 14 o 15.

18. Método para preparar un producto horneado que comprende la etapa de hornear la masa de acuerdo con la 5 reivindicación 17.