Variantes víricas de la hepatitis B con susceptibilidad reducida a análogos de nucleósidos y usos de las mismas.

Un ácido polinucleico de VHB aislado que codifica una variante de VHB,

dicho ácido polinucleico de VHB comprende una mutación nucleotídica que produce sustitución de aminoácidos rtA181S del gen de la ADN polimerasa en la variante de VHB, en donde dicha mutación nucleotídica produce una sensibilidad disminuida al análogo de nucleósido adefovir y lamivudina, dicho ácido polinucleico de VHB comprende un ácido polinucleico elegido del grupo que consiste en SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 6 y SEQ ID 7.

Variantes víricas de la hepatitis B con susceptibilidad reducida a análogos de nucleósidos y usos de las mismas

La presente se refiere al campo de las variantes del virus de la hepatitis B (VHB, también indicado con virus VHB) que muestran una sensibilidad reducida a agentes particulares. Más particularmente, la presente invención se refiere al campo de diagnosticar la susceptibilidad de una muestra de VHB a fármacos antivirales usados para tratar la infección por VHB y a un método lo ensayo para la detección rápida y fiable de mutaciones inducidas por fármacos en los genes del VHB que permiten la caracterización simultánea de una gama de codones implicados en la resistencia a fármacos.

El VHB es un virus de ADN pequeño con envuelta de aproximadamente 32 pb de longitud que pertenece a la familia de los hepadnavirus. El virus se replica a través de un intermedio de ARN y utiliza la transcripción inversa en su estrategia de replicación (Summers, 1982). El genoma del HVB es de una naturaleza compleja que tiene una estructura de ADN parcialmente bicatenario con marcos de lectura abiertos (ORF) solapantes que son (i) el ORF preC/C que codifica el antígeno e secretado (HBeAg) y la proteína nuclear de la nucleocápside (HBcAg), respectivamente; (ii) el ORF P que codifica la polimerasa/transcriptasa inversa vírica; (iii) el ORF preS1/preS2/S que codifica las proteínas de la envuelta vírica, el antígeno s (HBsAg) grande, mediano y pequeño, respectivamente; y (iv) el ORF X que codifica una proteína transactivadora transcripcional que codifica genes de superficie, núcleo, polimerasa y X.

Los virus de la hepatitis B muestran una gran variabilidad genética en sus genomas, siendo reconocidos actualmente siete genotipos de VHB (de A a G) (Stuyver et al., 21; Stuyver et al., 2). El virus, que se propaga por contacto con sangre infectada, puede causar estados de enfermedad debilitantes y puede producir insuficiencia hepática aguda. Aunque la mayoría de los adultos pueden rechazar una infección sin tratamiento, la infección por hepatitis B se puede desarrollar a una forma crónica. Realmente, aproximadamente 4 millones de personas en el mundo están crónicamente infectadas con VHB y se espera que aproximadamente del 15 al 4% de los portadores crónicos del VHB evolucione a cirrosis y enfermedad hepática terminal. Sin tratamiento el pronóstico para estos pacientes es malo, consecuentemente el desarrollo de terapia antiviral eficaz para VHB permanece un fin importante. El principal objetivo de la terapia es controlar la replicación del VHB e inducir la remisión de la enfermedad hepática para parar la evolución a cirrosis y cáncer hepático. El tratamiento está indicado para pacientes con inflamación activa, niveles de alanina aminotransferasa (ALT) elevados debido a la destrucción de las células hepáticas, y niveles del ADN de VHB (niveles de replicación vírica) mayores de 1. copias/ml.

Los fármacos actuales aprobados pata el tratamiento de hepatitis B crónica son los alfa-interferones, y análogos de nucleósidos o combinaciones de estos fármacos. Un análogo de nucleósido es un nucleótido químicamente manipulado que actúa como un bloque constructor sustituto en el proceso de replicación vírica, inhibiendo la replicación del VHB.

Se ha mostrado que la terapia con interferón (IFN) es parcialmente eficaz solo en un grupo pequeño de portadores (Lock, 1994) y también está limitada debido a los graves efectos secundarios. Este fracaso relativo de IFN-a para el tratamiento de infección crónica de VHB ha provocado la búsqueda de agentes y pautas terapéuticos adicionales. En particular, se ha mostrado que un número de análogos de nucleósidos inhiben la replicación de hepadnavirus a través de la inhibición de la ADN polimerasa/transcriptasa inversa hepadnavírica. Algunos de estos compuestos ya se han retirado del uso clínico debido a la toxicidad (lobucavir) o falta de eficacia (famciclovir) (De Clercq, 1999; Schinazi, 1997; Luscombe et al., 1996). En este momento, el análogo de nucleósido con más éxito para el tratamiento de hepatitis B crónica es sin duda el enantiómero (-) médicamente aprobado de 3-tiacitidina (3TC o lamivudina (LAM)), (Jarvis et al., 1999). El fármaco tiene una potente actividad antivírica contra el virus, se tolera bien y tiene pocos efectos adversos. Sin embargo, la terapia a largo plazo con lamivudina frecuentemente se asocia con la aparición de resistencia vírica. Una de las mutaciones comunes que confiere resistencia de lamivudina y reduce la eficacia de la replicación in vitro del virus es una sustitución de metionina a isoleucina o metionina a valina en el codón 24 de ADN dependiente de ARN de VHB (Ling R. et al., 1996; Bartholomew M. et al., 1997; Tipples G.A. et al., 1996). Además de la alteración de esta sustitución de aminoácido de Met a Val o a lie (rtM24V/l) en el motivo conservado YMDD, patrones genotípicos mutados en otros sitios del gen de la transcriptasa inversa se han asociado con resistencia a lamivudina. En particular, se describió que la mutación de leucina a metionina en el codón 18 (rtL18M) en el dominio B de la polimerasa restablece parcialmente la capacidad de replicación así como que aumenta la resistencia al fármaco in vitro. En pacientes coinfectados con VHB/VIH el desarrollo de resistencia a lamivudina es más frecuente que en pacientes monoinfectados con VHB, lo que hace una terapia alternativa a la aplicación de lamivudina indispensable (Benhamou etal., 21; Benhamou et al., 23; Benhamou et al., 24; Dore et al., 24).

Otro análogo de nucleósido aplicable para el tratamiento de hepatitis B crónica es adefovir dipivoxilo, el profármaco de adefovir (ADF). Estudios in vitro e in vivo han demostrado que este fármaco es capaz de inhibir cepas de VHB de tipo salvaje así como las que muestran resistencias de lamivudina. Por tanto, ADF puede servir como una terapia alternativa para el tratamiento de infección crónica por VHB en casos donde se ha producido la resistencia a lamivudina. Hasta ahora, ADF pasó con éxito estudios clínicos de fase III (Westland CE et al., 23). Ya se han

descrito dos mutaciones que median la resistencia a ADF. Estas mutaciones están localizadas en el codón 181 (dominio B) y en el codón 236 (dominio D) del gen de la transcriptasa Inversa y producen una sustitución de aminoácido de Ala a Val (rtA181V) y de Asn a Thr (rtN236T), respectivamente (Angus P. et al., 23; Yang H. et al., 23; documento WO 23/87351; documento WO 24/31224). La frecuencia de la mutación rtA181V es aproximadamente del 2,5% con una relevancia clínica hasta ahora desconocida, mientras que del 1,7-2,5% de los pacientes tratados con adefovlr revelan la mutación de resistencia rtN236T.

Estudios recientemente publicados por Perrillo et al. (24) así como por Peter ef al. (24) demuestran que aproximadamente del 85% al 92% de los pacientes con resistencia a lamivudlna tendrán una disminución en su nivel de ADN de VHB en más de o Igual a dos logs mientras reciben ADF. Esto Implica que del 8-15% de los pacientes no alcanzan una reducción significativa en los niveles de ADN de VHB cuando se añade ADF a la terapia. Por tanto, hay un precedente para un subgrupo de pacientes con VHB resistente a lamivudina que no alcanzarán una respuesta virológica con terapia de ADF. La razón para la no sensibilidad a ADF permanece poco clara.

Por tanto, aunque lamivudina y adefovir tienen efectos antivíricos fuertes, el desarrollo de mutantes que producen resistencia a fármacos presenta un problema importante en el tratamiento de infecciones crónicas de VHB. Además, la existencia de patrones de mutaciones en VHB con un perfil de resistencia cruzada plantea una preocupación principal debido a la posibilidad de fracaso de las terapias de combinación. Aunque se han descritos estudios que ensayan la resistencia cruzada de diferentes fármacos antivirales sobre mutantes de VHB (Delaney et al., (21), Xiong et al., (21)) no se ha documentado hasta ahora ningún patrón de mutación que sea responsable para la resistencia in vivo e in vitro tanto a adefovlr como lamivudina.

De lo anterior, parece que hay una necesidad de verificar la aparición o presencia de variantes de VHB que muestran una sensibilidad reducida a agentes particulares, para cribar y/o desarrollar y/o diseñar otros agentes que tienen propiedades adecuadas para hacerlos útiles en nuevas pautas terapéuticas. Según la presente Invención, los inventores han identificado variantes del VHB con mutaciones en el gen de la ADN pollmerasa de VHB que reducen la sensibilidad de VHB a análogos de nucleósidos.

Compendio de la invención

La presente invención se dirige a resolver el problema de seguimiento inadecuado de la aparición o presencia de vahantes del VHB que... [Seguir leyendo]

1. Un ácido polinucleico de VHB aislado que codifica una variante de VHB, dicho ácido polinucleico de VHB comprende una mutación nucleotídica que produce sustitución de aminoácidos rtA181S del gen de la ADN polimerasa en la variante de VHB, en donde dicha mutación nucleotídica produce una sensibilidad disminuida al análogo de nucleósido adefovir y lamivudina, dicho ácido polinucleico de VHB comprende un ácido polinucleico elegido del grupo que consiste en SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 6 y SEQ ID 7.

2. Un ácido polinucleico de VHB aislado según la reivindicación 1 que comprende una mutación nucleotídica adicional en el codón en posición 24 del gen de la ADN polimerasa en la variante de VHB y produce la sustitución de aminoácido de la metionina a isoleucina, en donde dicha mutación nucleotídica produce una sensibilidad disminuida al análogo de nucleósido adefovir y lamivudina, dicho ácido polinucleico de VHB comprende un ácido polinucleico elegido del grupo que consiste en SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 6 y SEQ ID 7.

3. Un ácido polinucleico de VHB aislado según las reivindicaciones 1 y 2 que comprende una mutación nucleotídica que produce la sustitución rtA181S en el dominio B del gen de la ADN polimerasa en la variante de VHB, y una mutación nucleotídica que produce la sustitución rtM24l en el dominio C del gen de la ADN polimerasa en la variante de VHB, dicho ácido polinucleico de VHB comprende un ácido polinucleico elegido del grupo que consiste en SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 6 y SEQ ID 7.

4. Un producto de expresión de VHB de un ácido polinucleico de VHB aislado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un poliaminoácido elegido del grupo que consiste en SEQ ID 1, SEQ ID 11 y SEQ ID 13.

5. Una composición que comprende un ácido polinucleico de VHB aislado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Una composición que comprende un producto de expresión de VHB como se describe en la reivindicación 4.

7. Uso de un ácido polinucleico de VHB aislado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un producto de expresión de VHB como se describe en la reivindicación 4 o una composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en un proceso in vitro para la selección de al menos un fármaco anti VHB sin resistencia cruzada.

8. Uso de un ácido polinucleico de VHB aislado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un producto de expresión de VHB como se describe en la reivindicación 4 o una composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en un proceso in vitro para la detección de una variante de VHB.

9. Un método para detectar la presencia de un ácido polinucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende:

a. obtener un ácido polinucleico de VHB diana de dicha muestra biológica en donde dicho ácido polinucleico de VHB diana se sospecha que comprende un codón 181 que codifica serina del dominio de la transcriptasa inversa del VHB, y opcionalmente uno o más codones elegidos del grupo que consiste en un codón 18 que codifica metionina, una codón 24 que codifica isoleucina o un codón 24 que codifica valina o un codón 24 que codifica serina, y un codón 236 que codifica treonina del dominio de la transcriptasa inversa de VHB de un virus VHB;

b. obtener la secuencia del ácido nucleico del ácido polinucleico de VHB diana de (a);

c. inferir, de la secuencia del ácido nucleico obtenida en (b), la presencia de dicho codón 181 que codifica serina del dominio de la transcriptasa inversa de VHB, y opcionalmente uno o más codones elegidos del grupo mencionado en (a),

y, de ello, la presencia de dicho virus VHB en dicha muestra biológica y/o dicha resistencia a un fármaco antiviral de un virus VHB presente en dicha muestra biológica.

1. Un método según la reivindicación 9 que comprende:

a. obtener un ácido polinucleico de VHB diana presente en dicha muestra biológica y/o obtener la secuencia de nucleótidos del mismo;

b. cuando sea apropiado, desnaturalizar parcial o completamente, o modificar enzimáticamente los ácidos polinucleicos obtenidos en el paso (a);

c. cuando sea apropiado, renaturalizar los ácidos polinucleicos desnaturalizados obtenidos en el paso (b), preferiblemente en presencia de al menos un oligonucleótido capaz de distinguir, en un ácido polinucleico de VHB un codón 181 que codifica serina en el dominio de la transcriptasa inversa de VHB de un codón

181 que codifica una alanina en el dominio de la transcriptasa inversa de VHB y, si es necesario, incluir el paso de modificar enzimáticamente, incluyendo extender, dicho oligonucleótido;

d. cuando sea apropiado, detección de los ácidos polinucleicos de VHB parcial o completamente desnaturalizados obtenidos en al paso (b), y/o de los híbridos formados en el paso (c), y/o de las modificaciones enzimáticas obtenidas en el paso (b) y/o (c);

e. inferir de uno o más de los datos de los siguientes grupos: los ácidos polinucleicos de VHB parcial o completamente desnaturalizados, los híbridos, las modificaciones enzimáticas, todos detectados en el paso (d), y de la secuencia de nucleótidos obtenida en (a), la presencia de dicho VHB en dicha muestra biológica y/o dicha resistencia a un fármaco antiviral de un VHB presente en dicha muestra biológica.

11. El método para detectar la presencia de un ácido polinucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende:

a. obtener un ácido polinucleico de VHB diana de dicha muestra biológica en donde dicho ácido polinucleico de VHB diana se sospecha que comprende un codón 181 que codifica serina del dominio de la transcriptasa inversa del VHB, opcionalmente junto con uno o más codones elegidos del grupo que consiste en un codón 18 que codifica metionina, un codón 24 que codifica isoleucina o un codón 24 que codifica valina o un codón 24 que codifica serina, y un codón 236 que codifica treonina del dominio de la transcriptasa inversa de VHB de un VHB;

b. poner en contacto el ácido polinucleico de VHB diana de (a) con un oligonucleótido capaz de distinguir un codón 181 que codifica una serina de un codón 181 que codifica una alanina, y opcionalmente también capaz de distinguir uno o más codones elegidos del grupo que cosiste en un codón 18 que codifica leucina de un codón 18 que codifica una metionina, un codón 24 que codifica isoleucina de un codón 24 que codifica una metionina, valina o serina, y un codón 236 que codifica una asparragina de un codón 236 que codifica una treonina;

c. inferir, de la señal distinguidora obtenida en (b), la presencia de dicho codón 181 que codifica serina de la transcriptasa inversa del VHB, opcionalmente junto con dicho codón 18 que codifica metionina o dicho codón 24 que codifica isoleucina o dicho codón 236 que codifica asparragina del dominio de la transcriptasa inversa de VHB y, de ello, la presencia de dicho VHB en dicha muestra biológica y/o dicha resistencia a un fármaco antiviral de un virus VHB presente en dicha muestra biológica.

12. Un método in vitro para cribar fármacos activos contra un VHB que comprende un ácido polinucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende

a. medir la replicación de dicho VHB en ausencia de dicho fármaco;

b. medir la replicación de dicho VHB en presencia de dicho fármaco;

c. inferir de (a) y (b) el efecto inhibidor de dicho fármaco en la replicación de dicho VHB.

13. Un oligonucleótido capaz de distinguir, en un ácido polinucleico de VHB como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un codón 181 que codifica una serina, de un codón 181 que codifica cualquier otro aminoácido en donde dicho ácido polinucleico muestra una sensibilidad reducida al análogo de nucleósido adefoviry lamivudina.

14. Un oligonucleótido según la reivindicación 13 capaz de distinguir un codón 181 que codifica una serina de un codón 181 que codifica una alanina.

15. Un kit diagnóstico para detectar la presencia de una variante de VHB en una muestra biológica y/o para detectar la resistencia a un fármaco antiviral de un VHB presente en una muestra biológica, dicho kit comprende un oligonucleótido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 capaz de distinguir un codón 181 que codifica una serina de un codón 181 que codifica una alanina, en donde dicha variante muestra una sensibilidad reducida al análogo de nucleósido adefoviry lamivudina.

16. Un kit diagnóstico según la reivindicación 15, dicho kit comprende un oligonucleótido adicional como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 capaz de distinguir un codón 24 que codifica una isoleucina de un codón 24 que codifica una metionina.