Vacunas peptídicas derivadas de EphA4.

Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas,

en donde dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 376 o 379.

Vacunas peptídicas derivadas de EphA4

Campo técnico La presente invención se refiere al campo de las ciencias biológicas, más específicamente al campo de terapia contra el cáncer. En particular, la presente invención se refiere a péptidos inmunogénicos novedosos que sirven como vacunas contra cáncer extremadamente eficaces, y fármacos para tratar y prevenir tumores que contienen tales péptidos.

Antecedentes técnicos Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos CD8+ (LTC) reconocen péptidos epítopos derivados de antígenos asociados a tumores (AAT) presentados en moléculas de MHC de clase I, y posteriormente lisan las células tumorales. Desde el descubrimiento de la familia MAGE como el primer ejemplo de AAT, se han descubierto muchos otros AAT usando planteamientos inmunológicos (Boon T. (1993) Int J Cancer 54: 177-80; Boon T. et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52) . Algunos de ellos están ahora en desarrollo clínico como dianas de inmunoterapia. Los AAT descubiertos hasta la fecha incluyen MAGE (van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7) , gp100 (Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347, 52) , SART (Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88) , y NY-ESO-1 (Chen Y.T. et al., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94: 1914-8) . Por otra parte, se ha mostrado que ciertos productos génicos que demostraron estar de alguna manera específicamente sobreexpresados en células tumorales son reconocidos como dianas para inducir respuestas inmunitarias celulares. Tales productos génicos incluyen p53 (Umano Y et al., (2001) Br J Cancer, 84:1052-7) , HER2/neu (Tanaka H et al., (2001) Br J Cancer, 84: 94-9) , CEA (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7) y similares.

A pesar del progreso significativo en la investigación básica y clínica respecto a los AAT (Rosenberg SA et al., (1998) Nature Med, 4: 321-7; Mukherji B. et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92: 8078-82; Hu X et al., (1996) Cancer Res, 56: 2479-83) , solo un número muy limitado de AAT candidatos adecuados para el tratamiento de cánceres están disponibles actualmente. Los AAT que se expresan abundantemente en células cancerosas, y cuya expresión está restringida a células cancerosas, serían candidatos prometedores como dianas inmunoterapéuticas.

Tanto HLA-A24 como HLA-A0201 son alelos de HLA comunes en las poblaciones japonesa y blanca (Date Y et al., (1996) Tissue Antigens 47: 93-101; Kondo A et al., (1995) J Immunol 155: 4307-12; Kubo RT et al., (1994) J Immunol 152: 3913-24; Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992) ; Williams F et al., (1997) Tissue Antigen 49: 129-33) . Por tanto, los péptidos antigénicos de cánceres presentados por estos alelos HLA pueden encontrar utilidad particular en el tratamiento de cánceres entre pacientes japoneses y blancos. Además, se sabe que la inducción de LTC de baja afinidad in vitro habitualmente resulta de exposición a altas concentraciones de péptidos, lo que genera un nivel alto de complejos péptido específico/MHC en células presentadoras de antígeno (CPA) , que activarán eficazmente estos LTC (Alexander-Miller et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7) .

Recientemente, se pueden esperar secuencias de péptidos que se unen a HLA de clase I usando algoritmos (Jounal of Immunological Methods, (1995) , Vol.185, pp.181-190, J. Immunol., (1994) , Vol.152, 163-175, protein science, (2000) , Vol.9, pp.1838-1846) . Sin embargo, es difícil decir que el péptido epítopo esperado se pueda cortar y expresar en la superficie de la célula diana con una molécula de HLA y ser reconocido por LTC. Además, el algoritmo, por ejemplo BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152 (1) :163-75; Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98 (6) :1872-81) ) puede sugerir el péptido que se une a la molécula HLA, pero el péptido sugerido no es demasiado riguroso (Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 22 Mar 2005;5:6) . Por tanto, el cribado de AAT aún mantiene muchos desafíos y dificultades.

Recientes desarrollos en las tecnologías de micromatrices de ADNc han permitido la construcción de perfiles exhaustivos de expresión génica en células malignas comparadas con células normales (Okabe, H. et al., (2001) Cancer Res., 61, 2129-37; Lin YM. et al., (2002) Oncogene, 21;4120-8; Hasegawa S. et al., (2002) Cancer Res 62:7012-7) . Este planteamiento permite un entendimiento más completo de la naturaleza compleja de las células cancerosas y los mecanismos de carcinogénesis y facilita la identificación de genes cuya expresión está desregulada en tumores (Bienz M. et al., (2000) Cell 103, 311-20) . Entre los transcritos identificados como aumentados en cánceres, CDH3 (No. de acceso de GenBank NM_001793; SEQ ID Nos.1, 2) , EPHA4 (No. de acceso de GenBank L36645; SEQ ID Nos.3, 4) , ECT2 (No. de acceso de GenBank AY376439; SEQ ID Nos.5, 6) , HIG2 (No. de acceso de GenBank NM_013332; SEQ ID Nos.7, 8) INHBB (No. de acceso de GenBank NM_002193; SEQ ID Nos.9, 10) , KIF20A (No. de acceso de GenBank NM_005733; SEQ ID Nos.11, 12) , KNTC2 (No. de acceso de GenBank AF017790; SEQ ID Nos.13, 14) , TTK (No. de acceso de GenBank NM_003318; SEQ ID Nos.15, 16) y URLC10 (No. de acceso de GenBank NM_017527; SEQ ID Nos.17, 18) se han descubierto recientemente. El contenido entero de las referencias se incorpora mediante referencia en el presente documento. Estos genes son de interés particular para los presentes inventores, estando específicamente aumentados en células tumorales de

varios tejidos cancerosos de los casos analizados (véase posteriormente) . Por tanto, los péptido inmunogénicos derivados de CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y URLC10 pueden encontrar utilidad en destruir selectivamente células tumorales que expresan tales antígenos. La presente invención aborda estas y otras necesidades.

Puesto que los fármacos citotóxicos, tal como M-VAC, con frecuencia producen reacciones adversas graves, está claro que la selección meditada de novedosas moléculas diana en base a mecanismos de acción bien caracterizados debe ser muy útil en el desarrollo de fármacos anticáncer eficaces que tienen un riesgo minimizado de efectos secundarios. Hacia este fin, se realizaron previamente análisis de perfiles de expresión en varios cánceres y tejidos humanos normales. Tales estudios produjeron el descubrimiento de múltiples genes que se sobreexpresan específicamente en cáncer (Lin YM, et al., Oncogene. 13 Jun. 2002;21:4120-8; Kitahara O, et al., Cancer Res. 1 Mayo 2001;61:3544-9; Suzuki C, et al., Cancer Res. 1 Nov. 2003;63:7038-41; Ashida S, Cancer Res. 1 Sep. 2004;64:5963-72; Ochi K, et al., Int J Oncol. Mar 2004, 24 (3) :647-55; Kaneta Y, et al., Int J Oncol. Sep. 2003 23:681-91; Obama K, Hepatology. Jun. 2005;41:1339-48; Kato T, et al., Cancer Res. 1 Jul 2005;65:5638-46; Kitahara O, et al., Neoplasia. Jul-Ag 2002;4:295-303.; Saito-Hisaminato A et al., DNA Res 2002, 9: 35-45) . Ejemplos de tales genes identificados como sobreexpresados en varios cánceres incluyen, pero no están limitados a, CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK y URLC10. CDH3 se ha identificado previamente como sobreexpresado en cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) , cáncer pancreático, tumor de tejidos blandos y tumor testicular. EPHA4 se ha identificado en cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, endometriosis, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata y tumor de tejidos blandos. ECT2 se ha identificado en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, leucemia mieloide crónica (LMC) , cáncer colorrectal, cáncer de esófago, NSCLC, linfoma, cáncer de próstata, carcinoma renal y cáncer de pulmón microcítico (SCLC) . HIG2 se ha identificado en carcinoma renal y SCLC. INHBB se ha identificado en carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, NSCLC, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejidos blandos. KIF20A se ha identificado en cáncer de vejiga, cáncer de mama, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, NSCLC, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y SCLC. KNTC2 se ha identificado en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en donde dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 376 o 379.

2. Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 376 y 379, en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, en donde dicho péptido induce una célula T citotóxica específica para una célula que expresa EphA4.

3. El péptido de la reivindicación 2, en donde el segundo aminoácido desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 376 o 379 se sustituye con leucina o metionina.

4. El péptido de la reivindicación 2 o 3, en donde el aminoácido C-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 376 o 379 se sustituye con valina o leucina.

5. Un péptido de la reivindicación 1, en donde dicho péptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 376 o 379.

6. Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, 44, 46, 48 y 78.

7. Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, 44, 46, 48 y 78 en la que un aminoácido está sustituido, en donde dicho péptido induce una célula T citotóxica específica para una célula que expresa EphA4.

8. Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 44, 46, 48 o 78 se sustituye con fenilalanina, tirosina, metionina

o triptófano, y/o el aminoácido C-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 44, 46, 48 o 78 se sustituye con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina, en donde dicho péptido induce una célula T citotóxica específica para una célula que expresa EphA4.

9. El péptido de la reivindicación 6, en donde el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 44, 46, 48 o 78.

10. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de cáncer, dicha composición comprende al menos un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un polinucleótido que codifica el péptido.

11. Un exosoma que presenta en su superficie un complejo que comprende un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y un antígeno HLA.

12. El exosoma de la reivindicación 11, en donde el antígeno HLA es HLA-A24.

13. El exosoma de la reivindicación 12, en donde el antígeno HLA es HLA-A2402.

14. Un exosoma que presenta en su superficie un complejo que comprende un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un antígeno HLA.

15. El exosoma de la reivindicación 14, en donde el antígeno HLA es HLA-A2.

16. El exosoma de la reivindicación 15, en donde el antígeno HLA es HLA-A0201.

17. Un método in vitro de inducir una célula presentadora de antígeno que tiene inducibilidad de células T citotóxicas, que comprende el paso de:

(a) poner en contacto una célula presentadora de antígeno con un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o

(b) transferir un gen que comprende un polinucleótido que codifica un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 a una célula presentadora de antígeno.

18. Un método in vitro de inducir una célula T citotóxica poniendo en contacto una célula T con un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

19. Un método in vitro de inducir una célula T citotóxica, que comprende los pasos de:

(i) poner en contacto una célula presentadora de antígeno con un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y

(ii) mezclar la célula presentadora de antígeno del paso (i) con una célula T CD8+ y cocultivar.

20. Una célula T citotóxica aislada, que se induce mediante el método de la reivindicación 18 o 19 o que se transduce con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de las subunidades de TCR que se unen a un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el contexto de HLA-A24 o HLA-A2.

21. Una célula presentadora de antígeno, que comprende un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o inducida por el método de la reivindicación 17.

22. Una vacuna para su uso en inhibir la proliferación de células que expresan un gen de SEQ ID NO: 3, en donde la vacuna comprende al menos un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como el principio activo.

23. La vacuna de la reivindicación 22, en donde las células que expresan un gen de SEQ ID NO: 3 son células cancerosas.

24. Un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un polinucleótido que codifica dicho péptido para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, la vacuna de la reivindicación 23, o el péptido o polinucleótido de la reivindicación 24, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, endometriosis, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, tumor de tejidos blandos y tumor testicular.

26. La vacuna de la reivindicación 25, formulada para la administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

27. Un método de identificar un péptido que tiene una capacidad de inducir una célula T citotóxica contra una célula que expresa EphA4, dicho método comprende los pasos de:

(i) proporcionar al menos una secuencia candidata que consiste en una secuencia de aminoácidos modificada mediante sustitución de uno o dos residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos original, en donde la secuencia de aminoácidos original se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, 44, 46, 48 y 78;

(ii) seleccionar la secuencia candidata que no tiene homología significativa con los péptidos derivados de cualquier producto génico humano conocido diferente de EphA4;

(iii) poner en contacto un péptido que consiste en la secuencia candidata seleccionada en el paso (ii) con una célula presentadora de antígeno;

(iv) poner en contacto la célula presentadora de antígeno del paso (iii) con una célula T para evaluar la capacidad del péptido de estimular la célula T; e

(v) identificar el péptido cuya inducibilidad de células T citotóxicas es igual que o mayor que la de un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos original.