Vacunas de flavivirus recombinantes.

Un flavivirus quimérico que comprende un virus de la fiebre amarilla de la cepa YF17D en el cual las proteínas de la membrana y de la envoltura del virus de la fiebre amarilla están reemplazadas por las proteínas de la membrana y de la envoltura de la cepa NY99 del virus del Nilo Occidental,

en donde dicho flavivirus quimérico comprende las mutaciones siguientes:

(a) las sustituciones L107F, A316V y K440R en la proteína de la envoltura;

(b) la deleción C2 (deleción de los aminoácidos PSR, residuos 40-42) en la proteína de la cápsida; y adicionalmente, o bien:

(c)(i) una deleción en la región 3' no traducida (3'UTR) del genoma de flavivirus quimérico seleccionada de: dB (deleción de CAGGT, nucleótidos 256-260), dD (deleción de CGGAG, nucleótidos 308-312) y d7 (deleción de AAGACGG, nucleótidos 345-351); o

(c)(ii) las sustituciones Y176V, T177A y K280M en la proteína de la envoltura.

Vacunas de flavivirus recombinantes Antecedentes de la invención

Los flavivirus son pequeños virus de RNA envueltos de cadena positiva que son transmitidos generalmente por mosquitos y garrapatas infectados. Varios flavivirus, tales como los virus de la fiebre amarilla, el dengue, la encefalitis japonesa, la encefalitis transportada por garrapatas, y el virus del Nilo Occidental, plantean amenazas actuales o posibles para la salud pública mundial. El virus de la fiebre amarilla, por ejemplo, ha sido la causa de epidemias en ciertas localidades de la jungla del África sub-sahariana, así como en ciertas partes de América del Sur. Aunque muchas infecciones por el virus de la fiebre amarilla son leves, el mal puede causar también una enfermedad grave amenazante para la vida. La fase inicial o aguda del estado de enfermedad se caracteriza normalmente por fiebre alta, escalofríos, dolor de cabeza, dolor de espalda, dolor muscular, pérdida de apetito, náuseas, y vómitos. Después de 3 a 4 días, estos síntomas desaparecen. En algunos pacientes, los síntomas reaparecen más tarde, cuando la enfermedad entra en su denominada fase tóxica. Durante esta fase, reaparece la fiebre alta que puede conducir a shock, hemorragias (v.g. hemorragia de la boca, nariz, ojos, y/o estómago), insuficiencia renal, e Insuficiencia hepática. De hecho, la insuficiencia hepática causa ictericia, que es un amarilleo de la piel y la parte blanca de los ojos, de donde deriva su nombre de "fiebre amarilla". Aproximadamente la mitad de los pacientes que entran en la fase tóxica mueren en el transcurso de 1 a 14 días. Sin embargo, las personas que se recuperan de la fiebre amarilla tienen inmunidad a lo largo de su vida contra la reinfección. El número de personas Infectadas con el virus de la fiebre amarilla a lo largo de las dos últimas décadas ha sido creciente, existiendo en la actualidad aproximadamente 2. casos de fiebre amarilla, y aproximadamente 3. fallecimientos asociados, cada año. La reaparición del virus de la fiebre amarilla presenta por tanto un grave problema de salud pública.

El virus del Nilo Occidental (WN) tiene una distribución amplia en África, el subcontinente indio, Europa, Ucrania, Rusia, Asia Central, y el Orlente Medio (Monath y Heinz, en Vlrology, 3a edición, Fields et al., editores, Lippincott- Raven pas. 961-134, 1995). En 1999, una epidemia sin precedentes de encefalitis en humanos y caballos causada por el virus WN ocurrió en los Estados Unidos (Enserlk, Science 286: 145-1451, 1999). Desde entonces, el virus se ha establecido permanentemente en las Amérlcas, afectando aproximadamente a todo el territorio de los Estados Unidos. Hasta ahora, el año de récord en términos de morbllldad/mortalidad en los Estados Unidos fue 23, con 9862 casos comunicados, de los cuales aproximadamente un tercio fueron acompañados por síntomas neurológlcos, y 264 fallecimientos. La enfermedad humana varía desde enfermedad moderada semejante al dengue a meningoencefalitis fatal, ocurriendo la enfermedad más grave en los ancianos. Hasta la fecha, no existe ningún tratamiento farmacológico eficaz contra el virus del Nilo Occidental, y los métodos de vigilancia y prevención no han causado impacto significativo en el número de casos de infección humana. Los riesgos de migración del virus a América del Sur, así como de epidemias en los países subdesarrollados, son extremadamente altos. El desarrollo de una vacuna segura y eficaz contribuirá al control de epidemias futuras.

Los flavivirus, con inclusión del virus de la fiebre amarilla y el virus del Nilo Occidental, tienen dos propiedades biológicas principales responsables de su inducción de estados de enfermedad en humanos y animales. La primera de estas dos propiedades es el neurotropismo, que es la propensión del virus a invadir e infectar el tejido nervioso del hospedador. La infección de flavivirus neutrópicos puede dar como resultado inflamación y lesión del cerebro y la médula espinal (a saber, encefalitis), consciencia deteriorada, parálisis, y convulsiones. La segunda de estas propiedades biológicas de los flavivirus es el viscerotropismo, que es la progresión del virus a invadir e infectar órganos viscerales vitales, que incluyen hígado, riñón, y corazón. La infección de flavivirus viscerotrópicos puede dar como resultado inflamación y lesión de hígado (hepatitis), riñón, (nefritis), y músculo cardiaco (miocarditis), que conducen a insuficiencia o disfunción de estos órganos.

El neurotropismo y el viscerotropismo parecen ser propiedades distintas y separadas de los flavivirus. Algunos flavivirus son fundamentalmente neurotrópicos (tales como el virus del Nilo Occidental), otros son fundamentalmente viscerotrópicos (v.g., el virus de la fiebre amarilla y el virus del dengue), y otros exhiben ambas propiedades (tales como el virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur). Sin embargo, tanto el neurotropismo como el viscerotropismo están presentes en cierto grado en todos los flavivirus. En un mismo hospedador, es probable que ocurra una interacción entre viscerotropismo y neurotropismo, dado que la infección de las visceras ocurre antes de la invasión del sistema nervioso central. Así pues, el neurotropismo depende de la capacidad del virus para replicarse en órganos extraneurales (visceras). Esta replicación extraneural produce viremia, que es responsable a su vez de la invasión del cerebro y la médula espinal.

Los viriones maduros totalmente procesados de los flavivirus contienen tres proteínas estructurales, cápsida (C), membrana (M), y envoltura (E). Siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS-, NS4A, NS4B, y NS5) se producen en las células infectadas. Ambos dominios de fijación y fusión de receptores virales residen en la proteína E. Adicionalmente, la proteína E es también un componente deseable de las vacunas de flavivirus, dado que los anticuerpos contra esta proteína pueden neutralizar la infectividad del virus y conferir protección al hospedador contra la enfermedad. Los flaviviriones inmaduros encontrados en las células infectadas contienen proteína premembranal (prM), que es un precursor de la proteína M. Las proteínas de flavivirus se producen por traducción de

un marco de lectura abierta simple y largo para generar una poliproteína, seguido por una serle compleja de escisiones proteolfticas de la poliproteína posteriores a la traducción, para generar proteínas virales maduras (Amberg et al., J. Viral. 73:883-894, 1999; Rice, "Flaviviridae,"en Virology, Fields et al., ed., Raven-Llpplncott, Nueva York, Volumen I, p. 937,1995). Las proteínas estructurales del virus están dispuestas en la región N-terminal de la pollpro- tefna en el orden C-prM-E, mientras que las proteínas no estructurales están localizadas en la reglón terminal C, en el orden arriba indicado.

Las vacunas vivas confieren las respuestas protectoras Inmunes más potentes y duraderas contra enfermedades causadas por infecciones virales. En el caso de los flavivirus, el desarrollo de una vacuna exitosa requiere que las propiedades de virulencia se modifiquen, a fin de que el virus de la vacuna exhiba neurotropismo y viscerotropismo reducidos para humanos o animales. Se han utilizado varios enfoques diferentes en el desarrollo de vacunas contra flavivirus. En el caso del virus de la fiebre amarilla, se han desarrollado dos vacunas (17D de la fiebre amarilla y la vacuna neutrópica Francesa) por paso seriado (Monath, "Yellow Fever," en Plotkin y Orensteln, Vacclnes, 3a ed., Saunders, Flladelfla, pp. 815-879, 1999). La vacuna 17D de la fiebre amarilla fue desarrollada por paso seriado en tejido de embrión de pollo, y dio como resultado un virus con neurotropismo y viscerotropismo significativamente reducidos. La vacuna neurotrópica Francesa fue desarrollada por paso seriado del virus en tejido cerebral de ratón, y dio como resultado la pérdida de viscerotropismo, pero retenía neurotropismo. De hecho, una alta Incidencia de accidentes neurológicos (encefalitis post-vacunal) estaba asociada con el uso de la vacuna Francesa.

Otro enfoque para la atenuación indica la construcción de flavivirus quiméricos, que incluyen componentes de dos (o más) flavivirus diferentes. Se han producido flavivirus quiméricos que incluyen proteínas estructurales y no estructurales de diferentes flavivirus. Por ejemplo, la denominada tecnología ChimeriVax emplea la cápslda del virus 17D de la fiebre amarilla y proteínas no estructurales para suministrar la proteína de la envoltura (prM y E) de otros flavivirus (véase, v.g. Chambers et al., J. Viral. 73: 395-311, 1999). De hecho, esta tecnología ha sido utilizada para desarrollar candidatos de vacuna contra los virus del dengue, el virus de la encefalitis Japonesa (JE), el virus del Nilo Occidental, y el... [Seguir leyendo]

1. Un flavivirus quimérico que comprende un virus de la fiebre amarilla de la cepa YF17D en el cual las proteínas de la membrana y de la envoltura del virus de la fiebre amarilla están reemplazadas por las proteínas de la membrana y de la envoltura de la cepa NY99 del virus del Nilo Occidental, en donde dicho flavivirus quimérico

comprende las mutaciones siguientes:

(a) las sustituciones L17F, A316V y K44R en la proteína de la envoltura;

(b) la deleción C2 (deleclón de los aminoácidos PSR, residuos 4-42) en la proteína de la cápsida; y adicionalmente, o bien:

(c) (¡) una deleclón en la reglón 3' no traducida (3UTR) del genoma de flavivirus quimérico seleccionada de: dB

(deleclón de CAGGT, nucleótldos 256-26), dD (deleclón de CGGAG, nucleótidos 38-312) y d7 (deleclón de

AAGACGG, nucleótldos 345-351); o

(c)(¡¡) las sustituciones Y176V, T177A y K28M en la proteína de la envoltura.

2. Un flavivirus quimérico según la reivindicación 1, que comprende la deleción dB en la 3UTR (deleción de CAGGT, nucleótidos 256-26).

3. Un flavivirus quimérico según la reivindicación 1, que comprende la deleción dD en la 3UTR (deleción de

CGGAG, nucleótidos 38-312).

4. Un flavivirus quimérico según la reivindicación 1, que comprende la deleción d7 en la 3UTR (deleción de AAGACGG, nucleótidos 345-351).

5. Un flavivirus quimérico según la reivindicación 1, que comprende las sustituciones Y176V, T177A y K28M 2 en la proteína de la envoltura.

6. Una composición farmacéutica que comprende el flavivirus quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6 para uso en un método para prevención o tratamiento de una infección de flavivirus en un individuo.

8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6 para uso según la reivindicación 7, en donde la

infección de flavivirus es una infección del virus del Nilo Occidental.

9. Una molécula de ácido nucleico que comprende el genoma del flavivirus quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.