Vacunas contra PRRSV basadas en proteínas GP5.

Un método para preparar una composición inmunogénica, comprendiendo dicho método:

(a) identificar o seleccionar un primer aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), comprendiendo dicho primer aislado un primer polipéptido GP5 que contiene una primera región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(b) identificar o seleccionar un segundo aislado de PRRSV, comprendiendo dicho segundo aislado un segundo polipéptido GP5 que contiene una segunda región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(c) combinar partículas virales de dicho primer y segundo aislado para formar una composición inmunogénica; donde:

- cada partícula viral comprende un polipéptido GP5 unido a membrana;

- la primera y segunda regiones HV-2 son diferentes entre sí;

y donde:

- cada una de las etapas de identificación o selección (a) y (b) comprende secuenciación de aminoácidos, secuenciación de ácido nucleico o detección basada en PCR de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV del aislado PRRSV.

Vacunas contra PRRSV basadas en proteínas GP5

Campo de la descripción

Esta descripción incluye composiciones y métodos dirigidos al uso de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) , o PRRSV, polipéptidos en la generación de una respuesta inmune contra el polipéptido, y por lo tanto PRRSV. La descripción se basa en parte en el reconocimiento de que el uso de más de un ectodominio GP5, que difiere en secuencia con una región hipervariable HV-2, permite la generación de una respuesta inmune más amplia contra PRRSV que con el uso de un único ectodominio. También se describe el uso de moléculas de ácido nucleico que codifican más de un ectodominio para producir una respuesta inmune más amplia. La descripción incluye composiciones que contienen polipéptidos con más de uno de los ectodominios, o una o más moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. También se describen métodos para producir una respuesta inmune usando polipéptidos, moléculas de ácido nucleico que los codifican, y/o una composición de la descripción.

Antecedentes de la descripción

PRRSV pertenece a la familia Ateriviridae, una de las familias de virus ARN animales. Las propiedades antigénicas de los virus PRRS, como otros virus ARN, cambian continuamente, lo que provoca una cuestión muy problemática en el desarrollo de una vacuna eficaz contra este agente que causa enfermedad. Sin embargo, existen fundamentos que no cambian en el sistema biológico de PRRSV. De forma importante, el virus infecta una célula hospedadora de un organismo multicelular para su replicación o crecimiento. Para infectar, el virus debe unirse a una célula hospedadora como parte de su ciclo vital. Para la unión, el virus debe tener una proteína de reconocimiento de receptor viral (RRP) que reconoce uno o más receptores específicos en la célula hospedadora. Por último, el receptor de la proteína hospedadora generalmente no cambia porque habitualmente es necesario para una función particular y de este modo no está pretendida para el reconocimiento del virus.

Pero un virus utiliza el receptor de la célula para unirse o reconocer la célula hospedadora. En lugar de modificar la estructura del receptor, un organismo que contiene la célula hospedadora puede producir anticuerpos que reconocen el RRP del virus para bloquear la unión del virus a la célula hospedadora. Los anticuerpos se mencionan habitualmente como anticuerpos neutralizantes (NA) . En respuesta, una población de virus a menudo contiene o produce modificaciones de su RRP que permite el escape del reconocimiento por NA. Sin embargo, las modificaciones al RRP están limitadas por el hecho de que el RRP modificado aún debe reconocer el receptor celular para la unión del virus. Si una modificación provoca un RRP no funcional, el virus no puede unirse, y de este modo no puede replicarse o sobrevivir.

Yaeger (2000) National Pork Board Research Report NPBnº 99-035 describe el efecto de la vacunación con combinaciones de vacunas comerciales contra PRRSV sobre el desarrollo de anticuerpos neutralizantes en suero para seis cepas antigénicamente diferentes de PRRSV.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método para preparar una composición inmunogénica, comprendiendo dicho método: 45

(a) identificar o seleccionar un primer aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) , comprendiendo dicho primer aislado un primer polipéptido GP5 que contiene una primera región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(b) identificar o seleccionar un segundo aislado de PRRSV, comprendiendo dicho segundo aislado un segundo polipéptido GP5 que contiene una segunda región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(c) combinar partículas virales de dicho primer y segundo aislado para formar una composición inmunogénica;

donde:

cada partícula viral comprende un polipéptido GP5 unido a membrana; la primera y segunda región HV-2 son diferentes entre sí;

y donde:

cada una de las etapas de identificación o selección (a) y (b) comprenden secuenciación de aminoácidos, secuenciación de ácido nucleico o detección basada en PCR de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV del aislado PRRSV.

La invención por tanto se refiere a un método para preparar composiciones inmunogénicas que comprenden 65 diferentes partículas virales PRRSV. La invención se basa en el descubrimiento inesperado de que materiales para generar una respuesta inmune contra PRRSV pueden obtenerse seleccionando ectodominios apropiados de la

proteína GP5 de PRRSV que varían en secuencia dentro de una región hipervariable HV-2 previamente no apreciada.

La siguiente descripción muestra cuáles son dichas proteínas y partículas virales, y a qué se parecerán las 5 composiciones que pueden obtenerse por el método de la invención.

Breve sumario de la descripción

La descripción se refiere a una disposición tridimensional de restos de aminoácidos presentes en la proteína GP5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) , o PRRSV. La disposición de restos, o dominio polipeptídico, está presente en la parte N-terminal de la proteína GP5, y se ha mencionado como ectodominio de la proteína GP5. La descripción incluye el uso del dominio en el contexto de un péptido, un polipéptido, una partícula viral, u otra composición que contenga proteína. En algunas realizaciones, el dominio puede estar presente en forma de un péptido o polipéptido recombinante o de fusión. En otras realizaciones, el dominio puede estar presente en, o con, una partícula viral o virus recombinante. En realizaciones adicionales, puede usarse una molécula de ácido nucleico que codifique un péptido o polipéptido que contenga el dominio para expresar el dominio para la práctica de la descripción.

La descripción se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que ectodominios que varían en secuencia dentro de una región hipervariable HV-2 previamente no apreciada, pueden seleccionarse para su uso en la preparación y uso de materiales para general una respuesta inmune, incluyendo una respuesta protectora, en un animal contra PRRSV. En algunos casos, se preparan al menos dos aislados PRRSV, conteniendo cada uno una proteína GP5 diferente debido a al menos una diferencia de secuencia dentro de la región HV-2, y se usan para generar una respuesta inmune. En otros casos, se preparan al menos tres o cuatro aislados PRRSV, conteniendo cada uno una proteína GP5 diferente debido a las diferencias de secuencia al menos dentro de la región HV-2, y se usan para producir una respuesta protectora.

La descripción incluye el reconocimiento de que después de una secuencia señal putativa, el ectodominio GP5 puede verse como una combinación de tres regiones que preceden a una región transmembrana putativa (o dominio que abarca membrana o MSD) . En orden secuencial desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal de la proteína GP5, las regiones son la región hipervariable HV-I ("HV1") , la región conservada ("CR") , y la región hipervariable HV-2 ("HV2") , que después está seguida por una región transmembrana putativa ("TR" o MSD) . La Figura 1 proporciona un ejemplo no limitante. Como la identificación del HV2 es importante para la generación de una respuesta inmune contra PRRSV, la descripción incluye combinaciones de al menos dos ectodominios GP5

donde difieren en secuencia del HV2. En algunos casos, los al menos dos ectodominios pueden estar presentes en al menos dos aislados PRRSV, que pueden administrarse para producir una respuesta inmune como se describe en este documento.

De modo que en un primer aspecto, la descripción incluye una combinación de al menos un primer dominio polipeptídico y un segundo dominio polipeptídico, donde cada domino contiene un motivo GP5 conservado unido de forma covalente a un HV2 y cada dominio es antigénico en un sujeto animal contra infección por PRRSV. En muchas realizaciones, la unión es un enlace peptídico, o enlace amida entre restos de aminoácidos en un polipéptido. El motivo GP5 y HV2 pueden ser contiguos de modo que el HV2 siga inmediatamente después del motivo en la misma molécula polipeptídica. En otras realizaciones, el motivo y HV2 pueden estar separados por un 45 enlazador, tal como uno o más restos de aminoácido. En realizaciones adicionales, el motivo y HV2 pueden estar unidos mediante un enlace químico diferente a un enlace peptídico.

Este aspecto de la descripción incluye realizaciones alternativas del primer y segundo dominio polipeptídicos donde al menos uno de los dominios es un dominio expandido que contiene adicionalmente... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una composición inmunogénica, comprendiendo dicho método:

(a) identificar o seleccionar un primer aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) , comprendiendo dicho primer aislado un primer polipéptido GP5 que contiene una primera región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(b) identificar o seleccionar un segundo aislado de PRRSV, comprendiendo dicho segundo aislado un segundo polipéptido GP5 que contiene una segunda región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5; 10 (c) combinar partículas virales de dicho primer y segundo aislado para formar una composición inmunogénica;

donde:

- cada partícula viral comprende un polipéptido GP5 unido a membrana.

15. la primera y segunda regiones HV-2 son diferentes entre sí;

y donde:

- cada una de las etapas de identificación o selección (a) y (b) comprende secuenciación de aminoácidos, 20 secuenciación de ácido nucleico o detección basada en PCR de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV del aislado PRRSV.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente identificar o seleccionar al menos un aislado PRRSV adicional con una región HV-2 diferente al primer y segundo aislados, y combinar partículas virales del al 25 menos un aislado PRRSV adicional con las partículas virales de dicho primer y segundo aislado.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los aislados están atenuados o inactivados.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha etapa de combinación (c) comprende adicionalmente la adición de uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha primera y dicha segunda regiones HV-2 son cada una de una secuencia diferente seleccionada entre E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7, E-8, D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7, D-8, S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7 y S-8; donde la secuencias de E-1 a E-8, D-1 a D-8 y S-1 a S-8 son como se muestran en la Tabla 3.

6. El método de la reivindicación 5, donde:

dicha primera y dicha segunda regiones HV-2 son cada una de una secuencia diferente seleccionada entre E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7 y E-8; o dicha primera región HV-2 es de la secuencia de uno de E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7 y E-8 y dicha segunda región HV-2 es de la secuencia de uno de D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7, D-8, S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S7 y S-8.