Vacuna de la tuberculosis de BCG recombinante para inducir respuestas inmunológicas contra Mycobacterium tuberculosis.

Un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante, en el que al menos un gen del regulón DosR estásobrerregulado y dicho BCG comprende al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que son diferentes entre sí yque cada una codifica uno o más genes que están sobreexpresados,

incluyendo dichas al menos dos secuencias deácidos nucleicos:

i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (Mtb);

y

ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de resucitación de Mtb o dereactivación de Mtb que no es un antígeno de DosR.

Vacuna de la tuberculosis de BCG recombinante para inducir respuestas inmunológicas contra Mycobacterium tuberculosis

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, a vacunas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) mejoradas que pueden evitar el desarrollo de síntomas de la tuberculosis, antes y después de la exposición al Mtb. En particular, la invención proporciona una vacuna basada en la subunidad del bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante mejorada en la que uno o más de los antígenos de Mtb y uno o más de los antígenos de resucitación o de reactivación de Mtb están sobreexpresados, y en la que al menos una porción del regulón DosR está sobrerregulada.

Antecedentes de la invención La actual vacuna de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) profiláctica (antes de la exposición) de BCG de Mycobacterium bovis (M. bovis) , introducida hace más de sesenta años, protege de forma eficaz contra la manifestación grave de la enfermedad en niños pero no evita el establecimiento de TB latente o de la enfermedad por reactivación de la infección en adolescentes y adultos. Además, casi todas las nuevas vacunas de Mtb que están en ensayos clínicos en la actualidad están diseñadas como vacunas profilácticas y no como vacunas profilácticas y terapéuticas (después de la exposición) .

Se cree que el Mtb avanza a través de una serie de etapas durante su ciclo infeccioso en el ser humano como una reacción a las respuestas inmunológicas humanas, y que cada etapa está orquestada por un programa genético diferenciado que dirige la expresión de antígenos específicos de la etapa. Si este concepto es válido, entonces una vacuna de la tuberculosis verdaderamente exhaustiva debería incluir antígenos que representen cada etapa, así como antígenos que sean independientes de la etapa. La tuberculosis latente (LTBI/latencia) parece ser una de estas etapas, y las pruebas actuales sugieren que el Mtb adopta un fenotipo fisiológico exclusivo durante la latencia que se caracteriza por una bacteriostasis (persistencia no replicativa) , un cambio de la respiración aerobia a la anaerobia, la expresión de la proteína chaperona pequeña !-cristalina (Acr/HspX) y una mayor resistencia a varios antibióticos micobacterianos.

El mantenimiento del estado de persistencia no replicativo, que se cree que es típico de Mtb en lesiones latentes, parece depender de la producción continua de las citoquinas Th1 (IFN∀, IL-12 y TNF!) y de óxido nítrico, y de la localización de MTB dentro de granulomas estables. Sin embargo, la reactivación de la infección de Mtb latente, que se caracteriza por la reanudación de la replicación bacteriana, una inflamación y cavitación, puede ser precipitada con prontitud por regímenes inmunosupresores (por ejemplo, corticosteroides o antagonistas de TNF!) , y aparece en 5-10% de individuos con infección latente, quizás debido a la tolerancia adquirida a micobacterias ambientales, la edad y, de modo más significativo, la enfermedad del VIH. Este escenario clínico habitual y el papel probado del sistema inmunológico celular para el mantenimiento de la latencia conduce a la conclusión de que la persistencia no replicativa es un fenotipo metaestable determinado por tres procesos que interaccionan entre sí: la replicación bacteriana dentro de las lesiones latentes está constreñida por efectores del sistema inmunológico celular; las bacterias dentro de las lesiones latentes controlan la producción de efectores inmunológicos; y una menor producción de efectores inmunológicos da como resultado la reanudación de la replicación.

Hasta la fecha no se han desarrollado vacunas satisfactorias que confieran inmunidad frente a la infección por Mtb y, al mismo tiempo, puedan tratar o prevenir el desarrollo de los síntomas de TB después de una exposición a Mtb, o como resultado de la reactivación de una infección latente. Una vacuna de BCG recombinante, modificada para inducir una respuesta inmunológica de este tipo, puede reducir las tasas de reactivación en personas con grados sutiles de inmunosupresión producida, por ejemplo, por el envejecimiento, la diabetes, la enfermedad del VIH, una tolerancia adquirida a micobacterias ambientales, o la desnutrición. Así, sigue siendo necesario el desarrollo de nuevas vacunas de TB, y sería particularmente útil desarrollar una vacuna que pueda utilizarse tanto de modo profiláctico como también para un tratamiento después de la exposición.

Sumario de la invención La presente invención se basa en el desarrollo de un nuevo bacillo de Calmette-Guerin recombinante (rBCG) para su uso como una vacuna. La vacuna puede utilizarse de modo profiláctico para evitar una infección por Mtb en individuos no expuestos. Sin embargo, la vacuna también es eficaz para tratar individuos que ya han sido expuesto y/o están infectados por Mtb. La vacuna evita el establecimiento de la infección y, de modo similar, evita la reactivación del Mtb latente en individuos que ya han sido previamente infectados. El rBCG que se emplea en la preparación de la vacuna está genéticamente modificado para que exprese antígenos "clásicos" de Mtb y antígenos relacionados con varias etapas del ciclo vital del Mtb, por ejemplo, latencia, reactivación y resucitación. Así, la respuesta inmunológica que se genera como resultado de una inmunización con la vacuna protege al individuo vacunado contra el desarrollo de una infección por Mtb activa en cualquiera y todas las etapas de la exposición a Mtb. En particular, el rBCG sobreexpresa 1) uno o más genes que codifican antígenos de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que se sabe que inducen potentes respuestas inmunológicas protectoras frente a Mtb; y 2) uno o más genes que codifican al menos un antígeno de resucitación o reactivación de Mtb. Las secuencias que codifican los antígenos están localizadas sobre un elemento extracromosómico o están integradas en el cromosoma del BCG recombinante. Además, la expresión de todo o parte del regulón Dos R está sobrerregulada en el nuevo rBCG.

Las realizaciones de la invención en las que las secuencias que codifican los antígenos están integradas en el cromosona se muestran de forma esquemática en la figura 1.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Representación esquemática del rBCG de la invención.

Figura 2. Diagrama del plásmido de integración y el módulo de expresión.

Figura 3A-D. Inmunotransferencias que demuestran la expresión de los módulos de antígenos integrados en el cromosoma. A, expresión de Rv0867c a partir del precursor de AERAS-407, AFV-102pRC108, carril 1 = AFV102pRC108, carril 2 = AFV-102; B, sobreexpresión de Ag85A y Ag85B a partir del precursor de AERAS-407, AFV102RC108, carril 1 = AFV-102, carril 2 = AFV-102pRC108; C, expresión de Rv3407 a partir del precursor de AERAS407, AFV-102pRC108, carril 1 = AFV-102, carril 2 = AFV-102pRC108; D, expresión de DosR (Rv3133c) a partir del precursor de AERAS-407, AFV-102pRC108, carril 1 = AFV-102, carril 2 = AFV-102pRC108.

Figura 4. Diagrama de un segundo plásmido de integración y módulo de expresión.

Figura 5A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv3804c (A, SEQ ID NO:1) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:2) .

Figura 6A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1886c (A, SEQ ID NO:3) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:4) .

Figura 7A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0867c (A, SEQ ID NO:5) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:6) .

Figura 8A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1009c (A, SEQ ID NO:7) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:8) .

Figura 9A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1884c (A, SEQ ID NO:9) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:10) .

Figura 10A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2389c (A, SEQ ID NO:11) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:12) .

Figura 11A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2450c (A, SEQ ID NO:13) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:14) .

Figura 12A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2623c (A, SEQ ID NO:15) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:16) .

Figura 13A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0288c (A, SEQ ID NO:17) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:18) .

Figura 14A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2626c (A, SEQ ID NO:19) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:20) .

Figura 15A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2005c (A, SEQ ID NO:21) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:22) .

Figura 16A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1996c (A, SEQ ID NO:23) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:24) .

Figura 17A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0685c (A, SEQ ID NO:25) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:26) .... [Seguir leyendo]

1. Un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante, en el que al menos un gen del regulón DosR está sobrerregulado y dicho BCG comprende al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que son diferentes entre sí y que cada una codifica uno o más genes que están sobreexpresados, incluyendo dichas al menos dos secuencias de ácidos nucleicos:

i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ; y

ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de resucitación de Mtb o de reactivación de Mtb que no es un antígeno de DosR.

2. El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que una o más de dichas al menos dos secuencias de ácidos nucleicos está integrada en un cromosoma de dicho rBCG.

3. El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que una o más de dichas al menos dos secuencias de ácidos nucleicos es una secuencia de ácido nucleico extracromosómica.

4. El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno de Mtb es 85A o dicho al menos un antígeno de Mtb es 85B.

5. El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno de resucitación o de reactivación de Mtb se selecciona del grupo que consiste en Rv0867c, Rv1009, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744c, Rv3347c, Rv1130 y Rv1169c.

6. El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se selecciona del grupo que consiste en Rv2623, Rv2626c, Rv2005c, Rv1996, Rv2029c, Rv2627c, Rv1908, Rv3837, Rv2780 y Rv1349.

7. El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que la expresión de dicho al menos un gen del regulón DosR está sobrerregulada por la actividad potenciada de un promotor.

8. Un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante según la reivindicación 1, que comprende al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que son diferentes entre sí y que cada una codifica uno o más genes que están sobreexpresados,

en el que al menos una primera secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rev1130, Rv1169c; y

en el que al menos una segunda secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rev3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c, Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rev1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132; y

en el que al menos un gen del regulón DosR está sobrerregulado.

9. Una composición de vacuna que comprende:

un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para inmunizar un sujeto contra una infección por Mtb o para inducir una respuesta inmunológica frente a Mtb en dicho sujeto,

en la que dicha composición de vacuna se administra en una cantidad suficiente para inmunizar a dicho sujeto contra una infección por Mtb o para inducir una respuesta inmunológica frente a Mtb en dicho sujeto.

10. La composición de vacuna de la reivindicación 9, para su uso según la reivindicación 9, en la que la composición de vacuna se adapta para ser administrada también como una composición de refuerzo que comprende uno o más antígenos de Mtb.

11. La composición de vacuna de la reivindicación 10, para su uso según la reivindicación 10, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rv3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c, Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rv1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132.

12. La composición de vacuna de la reivindicación 10, para su uso según la reivindicación 10, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1996, Rv2005, Rv2029, Rv2623, Rv2626 y Rv2727, o en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv2626, Rv1738, Rv2623, Rv1733, Rv2032, Rv3131, Rv3127, Rv3130c, Rv3804c y Rv1886c.

13. Una composición de vacuna que comprende un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para prevenir la recurrencia de los síntomas de la tuberculosis en un paciente con una infección por Mtb latente,

en la que dicha composición de vacuna se administra en una cantidad suficiente para prevenir la recurrencia de los síntomas de la tuberculosis en dicho paciente.

14. La composición de vacuna de la reivindicación 13, para su uso según la reivindicación 13, que comprende además la etapa de administrar una composición de refuerzo que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más antígenos de Mtb.

15. La composición de vacuna de la reivindicación 14, para su uso según la reivindicación 14, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rv3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c,

Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rv1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132.

16. La composición de vacuna de la reivindicación 14, para su uso según la reivindicación 14, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1996, Rv2005, Rv2029, Rv2623, Rv2626 y Rv2727, o en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv2626, Rv1738, Rv2623, Rv1733, Rv2032, Rv3131, Rv3127, Rv3130c, Rv3804c y Rv1886c.

17. La composición de vacuna de la reivindicación 10, para su uso según la reivindicación 10, en la que dicho uno o más antígenos incluye al menos un antígeno de cada etapa del ciclo vital de un Mtb.