Usos de formulaciones de gel.

Uso de una composición que comprende un copolímero de bloque de polioxietileno y polioxipropileno como matriz de soporte en el análisis de partículas,

en donde el copolímero de bloque está presente en la composición a una concentración gelificante, en donde la composición muestra las siguientes propiedades:

(a) termorreversibilidad gel-sol;

(b) formación de micelas en condiciones gelificantes;

(c) compatibilidad óptica;

(d) propiedades tensioactivas controlables;

(e) propiedades de tamiz molecular; y

(f) biocompatibilidad en donde la composición comprende adicionalmente perlas fluorescentes y/o un colorante; y

en donde las partículas se inmovilizan dentro de la composición de copolímero de bloque.

Usos de formulaciones de gel Campo de la invención La invención se refiere a composiciones de gel termorreversible y sus aplicaciones generalmente en investigación, ensayos de diagnóstico y exploración y metodología en el uso de aplicaciones basadas en matriz de soporte de células o partículas o reactivos.

Antecedentes a la invención Existe la necesidad de hacer ensayos biológicos más rápidos y más simples a realizar con urgencia primordial para hacer los procesos más baratos manteniendo aún la precisión y reproducibilidad. Esto se debe a un rápido aumento 15 en la cantidad de sondas moleculares de investigación y diagnóstico disponibles (por ejemplo, nuevas moléculas indicadoras fluorescentes) y las ventajas en términos de contenido de información de combinar dichos ensayos a través de una gama de instrumentos. Existe la necesidad creciente de ensayos basados en células, partículas y perlas (y una combinación de estas unidades) en que la presencia, por ejemplo, de células con ciertas características indica procesos patológicos. Asimismo, la demanda y evolución de enfoques racionas en la búsqueda de moléculas bioactivas para nuevas medicinas ha provocado la necesidad de exploración de alto rendimiento (HTS) a bajo coste y el desarrollo de ensayos basados en células y moléculas, herramientas y series dentro del campo de análisis funcional.

Dichos ensayos requieren de o se potencian mediante la disponibilidad de metodologías para:

i) la manipulación de células/partículas, analitos y reactivos en fases líquida y de gel para propósitos de procesamiento, ii) el suministro controlado de moléculas fluorescentes/bioluminiscentes a células/partículas o la retención de las 30 propiedades fluorescentes/bioluminiscentes asociadas de dichas partículas/células.

iii) la inmovilización controlable de dichas células/partículas para el propósito de análisis que implica recogida de luz

iv) la retención de viabilidad celular y función celular durante periodos de tiempo suficientes para los propósitos de un análisis.

La presente invención busca proporcionar medios para su uso en dichas metodologías.

Se conocen diversos hidrogeles basados en polímeros termorreversibles (en forma líquida a temperaturas elevadas pero en forma de gel a temperaturas inferiores) , incluyendo materiales que forman gel natural tales como agarosa, goma de agar, furcelarano, beta-carragenina, beta-1, 3-glucanos tales como curdlano, gelatina, o compuestos que contienen polioxialquileno.

La presente invención explota las distintas ventajas y propiedades de geles basados en copolímero de bloque de polioxipropileno y polioxietileno, es decir geles de copolímero de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (PBP) , que habitualmente experimentan transición a forma líquida tras reducción de temperatura. Esta propiedad puede describir como 'termoestabilidad invertida'.

Las propiedades seleccionadas de las preparaciones PBP, tales como propiedades detergentes y las propiedades mecánicas y termorreversibles de los hidrogeles en general, se han documentado y explotado en la técnica.

Por ejemplo, los usos y propiedades informados de preparaciones PBP incluyen los siguientes:

Propiedades tensioactivas El polímero de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (PBP) se ha usado como tensioactivo no iónico para detergentes, dispersantes, aglutinantes, estabilizantes, agentes antiespumantes, agentes emulsionantes por nombrar unos pocos. A elevadas concentraciones de PBP acuoso, más allá de una temperatura de transición, puede 60 formarse un gel que comprende micelas de copolímero de bloque anfífilo. Una preparación comercial Pluronic® F127 (PEO99-PPO69-PEO99, siendo E y P polioxietileno y polioxipropileno, respectivamente) se ha usado en forma de gel para preparaciones farmacéuticas.

Agar inverso y biopelículas Las formulaciones que forman gel de PBP se han descrito como 'agar inverso' en su uso. La formulación gelificante a baja temperatura se ha usado para dar soporte al crecimiento limitado de microorganismos en aplicaciones de microbiología convencional. Dichos hidrogeles basados en Pluronic® se han usado extensivamente para ensayar tratamientos biocidas. Las poblaciones de microorganismos atrapadas en gel imitan las elevadas densidades celulares localizadas observadas en biopelículas y están sometidas a gradientes similares de nutrientes y agentes químicos encontrados dentro de biopelículas naturales. Dichos usos de la técnica previa con respecto a microorganismos han revelado que PBP debe tener baja toxicidad en la forma estable de gel.

Propiedades de tamiz molecular La forma de gel PBP tiene el potencial de formar estructuras micelares ordenadas y se ha usado como medio de separación para ácidos nucleicos, que indica el movimiento coherente de moléculas a través del gel tras el paso de una corriente eléctrica continua o pulsada. También se han diseñado microdispositivos con geles de tamiz dentro del mismo dispositivo para realizar separaciones que implican ADN tanto monocatenario como bicatenario sobre distancias del orden de 1 cm. Se han hecho comparaciones extensivas para comparar diferentes matrices de gel sobre la base de la facilidad de moldeo del gel, la capacidad de reutilización, y el rendimiento de separación global usando por ejemplo un marcador en escalera de ADN bicatenario de 100 pares de bases como muestra patrón.

Hidroalmohadillas Se buscan tamaños de miniatura y alta sensibilidad de biochips en diagnóstico, ensayo, e investigación en medicina, ciencia y aplicaciones veterinarias, agricultura, toxicología, control ambiental, ciencia forense etc. Se han desarrollado biochips tridimensionales que comprenden geles no termorreversibles (hidroalmohadillas) que consisten en una serie de elementos de gel tridimensionales sobre la superficie hidrófoba de un portaobjetos de microscopio. Por ejemplo, se inició un proyecto de biochip basado en gel en Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Science (EIMB) en 1989 provocando el desarrollo de la 'microserie inmovilizada de elementos de gel' en chip (o chip IMAGE) , que puede dar soporte a oligonucleótidos, ADN, proteínas, compuestos pequeños o células fijados dentro de almohadillas de hidrogel semiesféricas. Se ha desarrollado un procedimiento simple de dos etapas para la fabricación a gran escala de dichos chips. Las almohadillas de gel pueden servir tanto como soporte para inmovilización y también como tubos de ensayo individuales de nanolitro para realizar diversas interacciones específicas, reacciones químicas o enzimáticas. Se han producido chips que contienen anticuerpos, antígenos, enzimas, receptores, y diferentes ligandos inmovilizados.

Encapsulación celular También se han explorado los geles poliméricos como materiales de encapsulación celular para ingeniería tisular. Las células y tejidos aislados de mamífero tienen incontables aplicaciones en medicina y biotecnología, pero la protección y nutrición de células in vitro o in vivo mientras se recogen los productos deseados ha demostrado ser difícil.

Suministro de fármacos y colorantes Aplicaciones clínicas previas han revelado el uso de hidrogeles con el propósito de suministro local de agentes farmacológicamente activos a tejidos. En contraste, trabajos previos sobre la tinción de células "poco líquidas" por difusión de colorante desde los geles (poliacrilamida o gelatina) se ha restringido al uso de gel sistemas que carecen de las propiedades termorreversibles únicas de geles basados en PBP. Dichos estudios se han descrito por Smolweski et al., 2001, Cytometr y 44 (4) :355-60. Se observó el suministro de colorante a células pero requería un aumento de 2 a 4 veces en la concentración normal de tinción de colorantes de ADN.

Saim et al., 2000 (The Lar y ngoscope, 110 (1) :1694-1697) describe un método de ingeniería tisular de cartílago que implica suspender células de condrocitos en una solución al 30 % (p/v) de Pluronic® F-127.

Zahn et al., 1999 (FEBS Let., 443 (3) :337-340) describe un ensayo celular de múltiples parámetros basado en el uso de un aparato de múltiples cámaras. El aparato comprende cuatro cámaras periféricas (o "satélite") recubiertas con un copolímero de bloque no adhesivo (Pluronic® F-68) conectadas mediante canales a una cámara central recubierta con proteína adhesiva de mejillón (MAP) . El copolímero de bloque no adhesivo se recubre sobre las cuatro cámaras satélite y las células se inyectan en cavidades dentro de la cámara recubierta.

El documento US 2004/033598 se refiere a composiciones de células multipotentes tipo espora y a su uso en la formación de piel artificial. Las... [Seguir leyendo]

1. Uso de una composición que comprende un copolímero de bloque de polioxietileno y polioxipropileno como matriz de soporte en el análisis de partículas, en donde el copolímero de bloque está presente en la composición a una concentración gelificante, en donde la composición muestra las siguientes propiedades:

(a) termorreversibilidad gel-sol;

(b) formación de micelas en condiciones gelificantes; 10 (c) compatibilidad óptica;

(d) propiedades tensioactivas controlables;

(e) propiedades de tamiz molecular; y

(f) biocompatibilidad

en donde la composición comprende adicionalmente perlas fluorescentes y/o un colorante; y en donde las partículas se inmovilizan dentro de la composición de copolímero de bloque.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que las partículas se obtienen de o constituyen una muestra biológica. 20

3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 en el que las partículas son células.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que las células están fijadas.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que las células están vivas.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que las células son no adherentes.

7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en el que las células se seleccionan entre el

grupo que consiste en células humanas, células animales, líneas celulares cultivadas, híbridos de células somáticas inmortales, células de levadura, células vegetales y células fúngicas.

8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en el que las células son capaces de expresar una molécula fluorescente. 35

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que las partículas son perlas fluorescentes.

10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el copolímero de bloque se

selecciona entre el grupo que consiste en poloxámero 407, poloxámero 338, poloxámero 288, poloxámero 237, 40 poloxámero 238, poloxámero 217, poloxámero 188 y poloxámero 108.

11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la composición se aplica a una superficie de un portaobjetos de microscopio, un cubreobjetos o una placa de múltiples cámaras.

12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la composición sirve como matriz de soporte para el análisis de partículas que implica la recogida de luz.

13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la composición sirve como matriz de soporte para el análisis de partículas por formación de imágenes, microscopía o ensayos basados en 50 placa no de imágenes.

14. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13 en el que la luz es fluorescencia, bioluminiscencia o quimioluminiscencia.

15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el análisis es para calibración, alineación óptica u orientación en metodologías que requieren la recogida de luz.

16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el análisis es para calibración, determinación de la función de propagación de punto y orientación de eventos en cortes ópticos de dos o más 60 dimensiones.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el colorante es un fluorocromo de ADN.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17 en el que el colorante es 1, 5-bis {[2- (metilamino) etil]amino}-4, 865 dihidroxi antraceno-9, 10-diona (DRAQ5â¢) .