Uso de bip contra la pérdida ósea y osteoporosis.

(1) Uso de BiP (proteína de unión a inmunoglobulina) o su variante,

homólogo, que tiene por lo menos 75, 85 o 90% de identidad de secuencia, derivado o fragmento, que tiene el efecto terapéutico o preventivo de BiP en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de pérdida ósea.

Uso de bip contra la pérdida ósea y osteoporosis Campo de la invención La presente invención se refiere al uso de BiP en la fabricación de una composición para la prevención o el tratamiento de pérdida ósea o resorción ósea. La presente invención se refiere también a métodos, tales como métodos diagnósticos y métodos de ensayo, composiciones farmacéuticas, animales transgénicos y métodos para prepararlos.

Antecedentes de la invención La remodelación ósea desrregulada es una parte importante de la patología de una serie de enfermedades. En dichas afecciones, la producción y activación aceleradas de la población de osteoclastos que resorben los huesos es causada por una red de mediadores aberrante todavía no identificada. En los últimos diez años, se han identificado las vías de señalización principales y los factores de transcripción que controlan el compromiso y la diferenciación de células madre hematopoyéticas y los precursores de monocitos/macrófagos al linaje de osteoclastos, proliferación y activación de osteoclastos (1-5) . Se reconoce ahora que la señalización mediante el activador del receptor de NF-kB (RANK) constitutivamente expresado en precursores de osteoclastos después de la unión al ligando RANK (RANKL) , junto con la activación por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) , produce una compleja serie de eventos que conducen a la producción de osteoclastos maduros. In vivo, tanto M-CSF como RANKL son provistos por los osteoblastos que, junto con el receptor señuelo osteoprotegerina (OPG) (6-7) , sirven para regular la diferenciación de osteoclastos y la resorción ósea. Es a través del componente de los osteoblastos que las hormonas sistémicas y las citocinas actúan indirectamente para influir en este proceso, donde la relación relativa de RANKL a OPG controla de manera crítica la osteoclastogénesis. En los estados patológicos (como artritis reumatoidea (AR) ) , no obstante, RANKL puede proveerse adicionalmente por las células T activadas, sinoviocitos de tipo fibroblastos y otras células estromales (8-10) . La unión RANKL-RANK activa las cascadas de señalización celular a través de varias etapas clave. El proceso depende del reclutamiento de proteínas del factor asociado al receptor de TNF (TRAF) , cascadas de proteína cinasa activadas por mitógenos (ERIC, JNK y p38) además de la activación mediada por Src y fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K) de Akt, y todas estas vías de señalización de RANK convergen en última instancia para activar varias familias de factores de transcripción, tales como NF-κB (11) , proteína activadora 1 (AP-1) (12) , particularmente c-Fos (13) , y factor nuclear de células T activadas (NFAT) , específicamente NFATc1 (1;5;14;15) . El hecho de que estas moléculas de señalización y factores de transcripción tienen roles esenciales en la diferenciación y activación de osteoclastos se ha demostrado inequívocamente en mutantes de ratones con pérdida de la función in vivo (5) .

Se han notificado las propiedades antiinflamatorias de una chaperona molecular humana que se conoce como proteína de unión a inmunoglobulina (BiP) o proteína regulada por glucosa (Grp) 78 (17) . El gen que codifica BiP se ha clonado y expresó la proteína humana recombinante (rhu) (documento WO 00/21995) .

La administración de rhuBiP a ratones con artritis inducida por colágeno (CIA) , previno la inducción de artritis experimental (17) . Una indicación del mecanismo de acción antiinflamatorio de BiP fue el hallazgo de que los clones de células T sensibles a rhuBiP produjeron las citocinas, IL-10, IL-4 y IL-5 (18) y que las células mononucleares (MC) de sangre periférica (PB) estimuladas por BiP produjeron altas concentraciones de IL-10 con atenuación recombinante de la producción de TNF-α. PBMC también produjo cantidades en aumento del agonista de IL-1R y TNFRII soluble (19) . Las citocinas liberadas de PBMC en respuesta a BiP regulan la osteoclastogénesis (20; 21) .

Para reforzar el hecho de que estas funciones extracelulares de BiP tienen relevancia biológica, el inmunoensayo de fluidos sinoviales ha revelado que la mayoría de aquellos pacientes con AR presentan BiP soluble (19) . También se sabe que la función de presentación de antígenos de los monocitos (MO) se reduce después de la disminución de expresión de CD86 y HLA-DR (19) , y que BiP demora y previene la maduración de PBMC purificadas en células dendríticas inmaduras (iDC) (22) .

El uso de BiP en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de respuesta inmunitaria no deseada se describe en el documento W002/072133.

El hueso es continuamente formado o digerido por células especiales llamadas osteoblastos u osteoclastos respectivamente. Hay muchas enfermedades en las que ocurre la erosión o el afinamiento óseo debido a un desequilibrio entre la formación ósea y la disolución ósea. Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de desarrollar fármacos que modulen (p. ej., prevengan) este proceso.

Compendio de la invención La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de que BiP inhibe, previene o disminuye la resorción ósea y la maduración de osteoclastos. Sin desear estar influenciados por ninguna teoría en particular, se cree que esta inhibición es eficaz a través de la modulación de vías de señalización esenciales, que son activadas

durante el proceso de diferenciación. Por consiguiente, BiP posee aplicación terapéutica, entre otros, en la pérdida ósea.

En el documento W002/072133, se describe que BiP tiene propiedades inmunomoduladoras y se describe el uso de BiP para tratar o prevenir una respuesta inmunitaria indeseada. Asimismo, se describe el uso de BiP para tratar enfermedades autoinmunitarias. A modo de ejemplo, esta cita describe que las células mononucleares de sangre humana cultivadas con BiP liberan IL-10, que puede reducir las enfermedades autoinmunitarias que se describen allí, tal como artritis reumatoidea (AR) . Asimismo, Corrigall et al. (17) describen que BiP se puede usar para inhibir el desarrollo de artritis reumatoidea y es candidata para la inmunoterapia de este trastorno. Por lo tanto, si bien se han descrito las propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias de BiP, no se describe en la técnica anterior el hallazgo sorprendente presentado en este documento de que BiP puede modular directamente la resorción ósea y la maduración de osteoclastos.

Ensayos de diferenciación de osteoclastos in vitro, que usan macrófagos de médula ósea de ratón (BMM) y PBMC humanas cultivadas en presencia de M-CSF y RANKL. Los resultados demuestran que en ensayos de diferenciación, tanto en ratones como en seres humanos, el número de osteoclastos visualizados por tinción para fosfatasa ácida resistente a fosfato (TRAP) , receptor de vitronectina (VnR, αvβ3) o presencia de anillos de actina F se redujo, y esto se correspondió con reducciones en la actividad de resorción (Figura 3) . Asimismo, la adición de BiP a osteoclastos maduros redujo el número de osteoclastos (Figura 4) . Además, en otra serie de experimentos que se describen en este documento, se han investigado cambios globales en la expresión génica en PBMO purificados en respuesta a BiP. Los experimentos que usan la tecnología de matriz génica Affymetrix han demostrado que el tratamiento con BiP de PBMO purificados causa reducción y aumento de muchos genes, en comparación con PBMO sin estimulación. BiP reduce la expresión de VnR (24) , CD44 (25) , osteopontina (26) , IKK

(14) y c-Fos (13) , los cuales tienen todos funciones importantes, o son esenciales para la diferenciación de osteoclastos (Figura 5) .

Aspectos compendiados de la presente invención En un primer aspecto, se da a conocer el uso de BiP o su variante, homólogo, derivado o fragmento en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de pérdida ósea.

En un segundo aspecto, se da a conocer el uso de BiP o su variante, homólogo, derivado o fragmento para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de resorción ósea.

También se describe el uso de BiP en la modulación de la maduración de osteoclastos.

También se describe un método para prevenir o tratar pérdida ósea, que comprende administrar BiP o su variante, homólogo, derivado o fragmento para causar un efecto preventivo o terapéutico beneficioso.

También se describe un método para prevenir o tratar resorción ósea, que comprende administrar BiP o su variante, homólogo, derivado o fragmento para causar un efecto preventivo o terapéutico beneficioso.

También se describe un método para modular el desarrollo de osteoclastos,... [Seguir leyendo]

(1) Uso de BiP (proteína de unión a inmunoglobulina) o su variante, homólogo, que tiene por lo menos 75, 85 o 90% de identidad de secuencia, derivado o fragmento, que tiene el efecto terapéutico o preventivo de BiP en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de pérdida ósea.

(2) Uso de BiP o su variante, homólogo, derivado o fragmento en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de resorción ósea.

(3) Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la pérdida ósea o la resorción ósea se asocia con enfermedad musculoesquelética.

(4) Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la enfermedad musculoesquelética es osteoporosis.

(5) Un método in vitro de diagnóstico de una enfermedad o síndrome causado o asociado con pérdida ósea, que comprende las etapas de:

(a) detectar la actividad de BiP en una muestra de un sujeto;

(b) comparar la actividad de BiP con aquella de un control no afectado; y

(c) comparar el valor obtenido del control con el valor obtenido del sujeto;

en donde una diferencia entre el valor obtenido del control y el valor obtenido del sujeto es indicativo de que el sujeto sufre la enfermedad o el síndrome.

(6) El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la actividad de BiP se reduce en comparación con los valores obtenidos del control.

(7) El método según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que comprende la etapa opcional de medir el desarrollo de osteoclastos o la resorción ósea

(8) Un método in vitro para determinar el efecto (s) de BiP o su variante, homólogo que tiene por lo menos 75, 85 o 90% de identidad de secuencia, derivado o fragmento que tiene el efecto preventivo o terapéutico de BiP sobre la diferenciación de osteoclastos, que comprende las etapas de:

(a) añadir BiP a uno o más osteoclastos que están en una o más etapas distintas de la diferenciación de osteoclastos; y

(b) determinar el efecto (s) de BiP sobre la osteoclastogénesis.

(9) Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que BiP se añade en una concentración de 0, 02-20 μg/ml.

(10) Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que el número de osteoclastos se cuantifica midiendo la actividad de TRAP, VnR y/o anillos de actina F.

(11) Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende la etapa opcional de cuantificar la resorción ósea.

(12) Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la diferenciación de osteoclastos se confirma usando PCR para medir la expresión de uno o más marcadores específicos de osteoclastos.

(13) Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el marcador (es) específico de osteoclastos es el gen receptor de calcitonina o el gen de catepsina K.

(14) Un método para identificar una o más proteínas moduladas por BiP durante la diferenciación de osteoclastos, que comprende las etapas de:

(a) diferenciar un osteoclasto en presencia y ausencia de BiP; y

(b) identificar una o más proteínas que se expresan de manera diferencial en un osteoclasto diferenciado en presencia de BiP en comparación con un osteoclasto diferenciado en ausencia de BiP.

(15) Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la proteína (s) comprende una molécula de señalización o un factor de transcripción.

(16) Un método de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que se añade BiP durante un periodo d.

2. 72 h o bien al comienzo del cultivo o hacia el final del cultivo cuando están presentes los osteoclastos multinucleados.

(17) Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el ácido nucleico codifica la proteína (s) , o la proteína (s) es detectada usando qt-RT-PCR y/o Western blotting.

(18) Uso de BiP o su variante, homólogo que tiene por lo menos 75, 85 o 90% de identidad de secuencia, derivado o fragmento que tiene el efecto terapéutico o preventivo de BiP en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la osteoporosis.