Uso de 4''-fosfopanteteinil transferasa como diana para identificar moléculas de anticuerpo.

Uso de una proteína PptT 4'-fosfopanteteinil transferasa de una bacteria patogénica que contiene ácidos micólicos como diana para el cribado in vitro de compuestos para identificar a aquellos que inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos,

en el que se identifica un compuesto que inhibe la biosíntesis de ácidos micólicos si inhibe dicha actividad de PptT.

Uso de 4’-fosfopanteteinil transferasa como diana para identificar moléculas de anticuerpo La cubierta celular desempeña un papel importante en la fisiología de Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de tuberculosis en seres humanos, una enfermedad que sigue siendo responsable de más muertes que ningún otro agente infeccioso individual. En primer lugar, esta estructura compleja proporciona una fuerte resistencia a la degradación por enzimas del hospedador y una barrera de permeabilidad para antibióticos y moléculas tóxicas producidas por el hospedador. En segundo lugar, contiene componentes que ejercen un efecto activo para facilitar la captación de la bacteria y para modular la respuesta inmunitaria del hospedador (Daffé y Draper, 1998) . La cubierta micobacteriana se caracteriza por un contenido muy alto de lípidos (60 % del peso seco) y la aparición de lípidos con estructuras inhabituales (Daffé y Draper, 1998) . Los constituyentes lipídicos principales de esta pared celular son los ácidos micólicos. Estas moléculas se encuentran específicamente en el suborden Cor y nebacterineae, que incluye corinobacterias, micobacterias, nocardias o rodococos, donde existen como ésteres de trehalosa o esterificados con el núcleo de arabinogalactano de la pared celular bacteriana (Daffé y Draper, 1998; Daffé, 2005) . Todos los ácidos micólicos consisten en α-alquil-β-hidroxiácidos grasos ramificados, pero su tamaño y su estructura difieren según la especie bacteriana (Asselineau et al., 2002) . Por ejemplo, los ácidos micólicos micobacterianos están compuestos por cadenas de carbono muy largas (C60-C90) que contienen motivos adicionales tales como funciones oxígeno, anillos de ciclopropilo o ramificaciones de metilo, mientras que Cor y nebacteria spp produce una mezcla de ácidos corinomicólicos saturados e insaturados que oscilan típicamente en tamaño de 30 a 36 carbonos. Los ácidos micólicos son componentes estructurales clave de la cubierta celular y su ruta de biosíntesis es la diana del importante fármaco antituberculoso isoniazida (Banerjee et al., 1994) . Se ha encontrado que la estructura del micolato es crítica para la replicación inicial y persistencia in vivo (Takayama et al., 2005) . En micobacterias de crecimiento lento, los ácidos micólicos están asociados a una serie de lípidos extraíbles que contienen ácidos grasos ramificados con metilo (Minnikin et al., 2002) . Diversos estudios han mostrado que algunos de estos compuestos, tales como los dimicocerosatos de ftiocerol (DIM) y glicolípido fenólico (PGL-tb) , contribuyen a la patogenia de M. tuberculosis (Camacho et al., 1999; Reed et al., 2004) .

La biosíntesis de los diversos e inhabituales lípidos de M. tuberculosis implica la acción combinada de sistemas de ácido graso sintasa (Fas) y policétido sintasas de tipo I (Pks) . Por ejemplo, la formación de micolatos requería dos sistemas Fas y una Pks: Fas-I, una proteína multifuncional, está dedicada a la producción de ácidos grasos cortos C16, 18; Fas-II, un complejo de proteínas monofuncionales, alarga los ácidos grasos generados por Fas-I, proporcionando ácidos grasos de cadena larga de longitud que oscila de C48 a C64; Pks13 cataliza la condensación de dos ácidos grasos, formando ácidos micólicos (Takayama et al., 2005; Portevin et al.; 2004) . La biosíntesis de DIM y PGL-tb requiere Fas-I y 7 Pks (Onwueme et al., 2005) . Finalmente, Fas-I y Pks2 o Pks3/4 están implicadas en la formación de diversos ácidos grasos ramificados multimetílicos encontrados en los lípidos derivados de trehalosa específicos de M. tuberculosis (Sirakova et al., 2001; Dubey et al., 2002) . Globalmente, el genoma de M. tuberculosis codifica más de 18 Pks de tipo I y dos sistemas Fas (Cole et al., 1998) . Estas enzimas son los actores clave que dotan a M. tuberculosis con la capacidad única de producir una variedad impresionante de lípidos de estructura única.

Para ser funcionales, los dominios de proteína portadora de acilo (ACP) de Fas y Pks tienen que convertirse desde sus apoformas inactivas a sus holoformas funcionales mediante la unión covalente de un grupo 4’-fosfopanteteína (P-pant) a un grupo hidroxilo de un residuo de serina invariable (Walsh et al., 1997; Keating y Walsh, 1999) . El papel de este brazo protésico flexible es proporcionar un sitio de unión para intermedios de extensión de cadena y transportar las cadenas en crecimiento entre los diferentes sitios catalíticos de los complejos de sintasa (Cane y Walsh, 1999) . Este rasgo es compartido por otra clase de enzimas, las péptido sintasas no ribosómicas (NRPS) , que están implicadas en la producción de sideróforos en M. tuberculosis (De Voss et al., 1999) . Esta modificación postraduccional se cataliza por una 4’-fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere el grupo P-pant desde la coenzima A (CoA) al ACP (Lambalot et al., 1996) . Las PPTasas se han identificado y caracterizado bioquímicamente en una serie de microorganismos y se han clasificado en tres grupos basándose en la similitud de secuencia primaria y la especificidad de sustrato (Wiessman et al., 2004 y referencias en el mismo) . Los miembros del primer grupo ejemplificado por la holo (proteína portadora de acilo) sintasa (AcpS) de Escherichia coli son de aproximadamente 120 residuos de tamaño y actúan como homotrímeros (Parris et al., 2000) . Estas PPTasas de tipo AcpS tienen una especificidad de sustrato estrecha limitada al ACP de Fas de tipo II y sistemas Pks (Mootz et al., 2001) . El segundo grupo comprende PPTasas que se parecen a la proteína Sfp (fosfopanteteinil transferasa de surfactina) , una PPTasa necesaria para la producción del antibiótico surfactina en Bacillus subtilis (Quadri et al., 1998a) . Estas PPTasas de tipo Sfp son de aproximadamente el doble de tamaño que aquellas del primer grupo (220-240 residuos) y existen en forma monomérica (Mofid et al., 2004) . Están a menudo asociadas a genes que codifican la producción de metabolitos secundarios, pero exhiben especificidades de sustrato muy amplias y son habitualmente capaces de modificar tanto los dominios ACP de tipo I y tipo II como de proteína portadora de peptidilo (PCP) (Weissman et al., 2004; Quadri et al., 1998a) . Las PPTasas del tercer grupo se incorporan como un dominio catalítico a Fas de tipo I y permiten la autofosfopanteteinilación del dominio ACP de la proteína (Fichtlscherer et al., 2000) .

Habitualmente, las bacterias contienen más de una PPTasa dedicada a una o varias rutas dependientes de P-pant. Por ejemplo, E. coli tiene tres PPTasas (Lambalot et al., 1996) , AcpS implicada en la síntesis de ácidos grasos, EntD 2 10

una PPTasa de tipo Sfp implicada en la biosíntesis del sideróforo enterobactina, y el producto del gen yhhU que tiene una función fisiológica desconocida. Se ha mostrado que AcpS es esencial para la viabilidad celular, pero no EntD (Flugel et al., 2000) . En contraposición, en Bacillus subtilis que tiene dos PPTasas, Sfp puede complementar la actividad de AcpS y mantener la biosíntesis de ácidos grasos después de la inactivación de acpS (Mootz et al., 2001) .

En su análisis inicial del genoma de M. tuberculosis, Cole et al. (1998) identificaron a Rv2523c como un gen que codifica una presunta PPTAsa relacionada con AcpS. Al mismo tiempo, se descubrió una segunda PPTasa en M. tuberculosis por Quadri et al. (1998b) , quienes encontraron que Rv2794c codifica una PPTasa de tipo Sfp, renombrada PptT, que era capaz de activar in vitro dos NRPS necesarias para el ensamblaje del sideróforo micobactina. Sin embargo, a pesar de la importancia del sistema Fas-I y las Pks de tipo I para la biología de M. tuberculosis, no se han reseñado datos referentes a la modificación postraduccional de estas enzimas en micobacterias. Se han identificado dos PPTasas que serían responsables de la activación de más de 20 proteínas en M. tuberculosis, pero sus repertorios respectivos de sustratos, su presunta redundancia y su importancia para la biología micobacteriana no se han investigado anteriormente. Responder a estas preguntas es crucial para entender la biosíntesis de lípidos en M. tuberculosis.

Los inventores han encontrado ahora que se encuentran ortólogos de las dos PPTasas de M. tuberculosis identificadas anteriormente en otras especies de Cor y nebacterineae. Han demostrado que ambas PPTasas son esenciales para el crecimiento de micobacterias y ostentan funciones idénticas en micobacterias y corinobacterias: AcpS es responsable de la modificación postraduccional de Fas-I y PptT, la PPTasa de tipo Sfp, está implicada en la activación de la enzima condensadora Pks13. Además, han mostrado que las diversas Pks de tipo I necesarias para la formación de factores de virulencia lipídicos se activan por PptT... [Seguir leyendo]

1. Uso de una proteína PptT 4’-fosfopanteteinil transferasa de una bacteria patogénica que contiene ácidos micólicos como diana para el cribado in vitro de compuestos para identificar a aquellos que inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos, en el que se identifica un compuesto que inhibe la biosíntesis de ácidos micólicos si inhibe dicha actividad de PptT.

2. El uso según la reivindicación 1, en el dicha proteína PptT es de una bacteria seleccionada del grupo consistente en corinobacterias, micobacterias y nocardias.

3. El uso según la reivindicación 2, en el que dicha proteína PptT es de una bacteria seleccionada del grupo consistente en Cor y nebacterium diphtheriae, Cor y nebacterium minutissimum, Cor y nebacterium pseudotuberculosis,

Mycobacterium africanum, Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium leprae, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium microti, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium xenopi, Nocardia asteroids, Nocardia brasiliensis, Nocardia farcinica, Nocardia nova y Nocardia otitidiscaviarum.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de aminoácidos de dicha proteína PptT se selecciona del grupo consistente en las SEQ NO: 2 a 9.

5. Un proceso de cribado in vitro para identificar compuestos que inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos, caracterizado porque se mide la actividad de una proteína PptT 4’-fosfopanteteinil transferasa de una bacteria patogénica que contiene ácidos micólicos en presencia o ausencia de dichos compuestos, en el que se identifica un compuesto que inhibe la biosíntesis de ácidos micólicos si inhibe dicha actividad de PptT.

6. El proceso según la reivindicación 5, en el que dicha actividad de PptT se mide (i) incubando una PptT aislada con una proteína Pks o subunidad de la misma que comprende un dominio de proteína portadora de acilo, y con una acetil-CoA marcada, (ii) precipitando dicha proteína Pks o subunidad de la misma y (iii) midiendo el nivel de marcaje de dicho precipitado.

7. El proceso según la reivindicación 5 o 6, en el que dicha PptT es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

Figura 1

Figura 2

Figura 4