Supresión de tumor usando perfusato placentario humano y células asesinas naturales intermediarias que provienen de placenta humana.

Células nucleadas humanas del perfusato placentario para usar en un método para el tratamiento de un tumor en un individuo,

en donde las células nucleadas humanas del perfusato placentario comprenden células asesinas naturales placentarias intermedias CD56+, CD16- y son susceptibles de obtenerse mediante la perfusión de un ser humano placenta que se ha drenado del cordón umbilical y se enjuaga para retirar sangre residual para producir el perfusato placentario que comprende células placentarias nucleadas; y aislamiento de las células placentarias nucleadas de dicho perfusato placentario.

Supresión de tumor usando perfusato placentario humano y células asesinas naturales intermediarias que provienen de placenta humana

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nro. 6/995,763, presentada el 28 de septiembre de 28, y la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nro. 61/9,555, presentada el 21 de agosto de 28.

1. Campo de la invención

Se divulgan en este documento métodos para suprimir el crecimiento o la proliferación de células tumorales mediante contactar las células tumorales con perfusato placentario, células derivadas de perfusato placentario, células asesinas naturales de la placenta, p. ej., del perfusato placentario, y/o células asesinas naturales combinadas que comprenden células asesinas naturales de la placenta, p. ej., del perfusato placentario y células asesinas naturales de la sangre del cordón umbilical. También se divulgan en la presente métodos para producir una población única de células asesinas naturales de la placenta, p. ej., del perfusato placentario, p. ej., perfusato placentario humana. Se divulgan además en la presente métodos de uso del perfusato placentario, y las células asesinas naturales obtenidas de allí, para suprimir la proliferación de células tumorales.

2. Antecedentes de la invención

El perfusato placentario comprende una colección de células placentarias obtenidas mediante el pasaje de una solución de perfusión a través de la vasculatura de la placenta, y la colección del fluido de la perfusión de la vasculatura, de la superficie materna de la placenta o de ambos. Los métodos para producir la perfusión de las placentas de los mamíferos se describen, p. ej., en la Patente de Estados Unidos Nro. 7.45.146 y la Patente de Estados Unidos Nro. 7.255.879. La población de células placentarias obtenidas por perfusión es heterogénea, comprendiendo células hematopoyéticas (CD34+), células nucleadas tales como granulocitos, monocltos y macrófagos, un porcentaje pequeño (menos de 1 %) de células madre de placenta adherentes al sustrato de cultivo de tejidos, y células asesinas naturales. Nadie hasta la fecha ha descrito el uso del perfusato placentario, o las poblaciones de células placentarias del perfusato, en la supresión de la proliferación de células tumorales.

Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos cltotóxlcos que constituyen un componente principal del sistema ¡nmunológlco Innato. Las células NK no expresan los receptores de antígenos de células T (TCR), CD3 o el receptor de células B de ¡nmunoglobullnas de superficie (Ig), pero normalmente expresan los marcadores de superficie CD16 (FcyRIII) y CD56 en los seres humanos. Las células NK son cltotóxlcas; los gránulos pequeños en su citoplasma contienen proteínas especiales tales como perforlna y proteasas conocidas como granzlmas. Tras la liberación en cercana proximidad a una célula seleccionada para matar, la perforlna forma poros en la membrana celular de la célula diana a través de los cuales las granzlmas y las moléculas asociadas pueden Ingresar, induciendo la apoptosis. Una granzima, la granzlma B (también conocida como granzlma 2 y esterasa de serlna asociada con los linfocitos T citotóxicos 1), es una proteasa de serlna crucial para la rápida Inducción de la apoptosis de células diana en la respuesta inmunológica mediada por células.

Las células NK se activan como respuesta a los ¡nterferones o cltoqulnas derivadas de macrófagos. Las células NK activadas se mencionan como células asesinas activadas por llnfoclnas (LAK). Las células NK poseen dos tipos de receptores de la superficie, marcados como "receptores de activación" y "receptores de inhibición," que controlan la actividad citotóxica de las células.

El uso de una composición que comprende extracto de tejidos derivado de placenta o células CD34+ de la sangre del cordón umbilical o de tejido placentario para Inducir la diferenciación de células con cáncer en células de malignidad reducida, o que carecen de malignidad se divulga en la Publicación de Patente de Estados Unidos Nro.

27/41954.

La Publicación de Patente de Estados Unidos Nro. 23/6836 se refiere a un medio y a un método para expandir las células asesinas naturales que expresan el fenotipo CD56+CD3, en donde las células asesinas naturales pueden obtenerse de cualquier fuente comercial, preferentemente de sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical, líneas celulares o sangre periférica estimulada por citoqulnas.

Takahashl E. et al, 27, Scandinavian Journal of Immunology 65, 126-138, describe el uso de diferentes citoquinas para la inducción de citotoxicidad antitumoral de células asesinas naturales CD16+CD56br'9ht obtenidas de la sangre periférica.

Roussev R. G. et al, 1993, Journal of Reproductive Immunology 25: 15-29, se refiere a la caracterización fenotípica de leucocitos mononucleares de placenta humana normal.

Entre otras actividades, las células NK cumplen una función en el rechazo del huésped de los tumores. Dado que las células con cáncer tienen reducida o ninguna expresión de MHC clase I, se han convertido en blanco de las células NK. Los datos clínicos acumulados sugieren que el trasplante haploldéntlco de las células NK humanas aisladas de

PBMC o médula ósea media potentes efectos anti-leucémicos sin poseer la enfermedad de huésped versus injerto detectable (GVHD). Véase Ruggeri et al, Science 295:297-21 (22)). Las células asesinas naturales pueden activarse mediante células que carecen de, o que muestran niveles reducidos de, proteínas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). Las células NK y las células LAK activadas y expandidas se han utilizado tanto en la terapia ex vivo como en el tratamiento in vivo de pacientes que tienen cáncer en estado avanzado, con cierto éxito contra las enfermedades relacionadas con la médula ósea, tales como leucemia; cáncer de mama; y ciertos tipos de linfoma. El tratamiento con células LAK requiere que el paciente reciba primero IL-2, seguido de leucoferesis y luego una incubación ex vivo y cultivo de las células sanguíneas autólogas cosechadas en presencia de IL-2 durante algunos días. Las células LAK deben volver a infusionarse con dosis relativamente altas de IL-2 para completar la terapia. Este tratamiento de purga es costoso y puede producir efectos colaterales adversos. Estos Incluyen retención de líquidos, edema pulmonar, caída en la presión arterial, fiebre alta.

A pesar de las propiedades ventajosas de las células NK en la matanza de células tumorales y células Infectadas con virus, continúa siendo difícil trabajar con ellas y aplicarlas en la terapia inmunológica, principalmente debido a la dificultad de mantener sus capacidades orientadas al tumor y tumoricidas durante el cultivo y la expansión. Asi, existe una necesidad en la técnica de lograr un amplio suministro de células asesinas naturales.

La presente invención se refiere a células nucleadas humanas de perfusato placentarlo para utilizar en un método para el tratamiento de un tumor en un individuo, en donde las células nucleadas humanas de perfusato placentarlo comprenden células asesinas naturales intermedias placentarias CD56+, CD16 y son susceptibles de obtenerse mediante la perfusión de una placenta humana que se ha drenado de la sangre del cordón y enjuagado para eliminar sangre residual para producir el perfusato placentario que comprende las células placentarias nucleadas; y el aislamiento de las células placentarias nucleadas de dicho perfusato placentario.

La presente invención se refiere además a células asesinas naturales intermediarias placentarias humanas CD56+, CD 6 para utilizar en un método para el tratamiento de un tumor en un individuo, en donde dichas células asesinas naturales intermediarias placentarias expresan uno o más de los microARNs hsa-miR-1, hsa-miR-127, hsa-m¡R- 211, hsa-m¡R-32c, hsa-m¡R-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-52g, hsa-miR-52h, hsa-miR-564, hsa-m¡R- 566, hsa-miR-618 o hsa-miR-99a, a un nivel detectablemente más alto que las células asesinas naturales de la sangre periférica.

Finalmente, la presente invención se refiere a células asesinas naturales combinadas para usar en un método de tratamiento de un tumor en un individuo, en donde dichas células asesinas naturales combinadas comprenden células asesinas naturales intermediarias placentarias humanas CD56+, CD16 aisladas de perfusato placentario y células asesinas naturales aisladas de la sangre del cordón umbilical y en donde dicha sangre del cordón umbilical se aísla de la placenta de... [Seguir leyendo]

1. Células nucleadas humanas del perfusato placentario para usar en un método para el tratamiento de un tumor en un individuo, en donde las células nucleadas humanas del perfusato placentario comprenden células asesinas naturales placentarias intermedias CD56+, CD16' y son susceptibles de obtenerse mediante la perfusión de un ser humano placenta que se ha drenado del cordón umbilical y se enjuaga para retirar sangre residual para producir el perfusato placentario que comprende células placentarias nucleadas; y aislamiento de las células placentarias nucleadas de dicho perfusato placentario.

2. Las células nucleadas humanas del perfusato placentario para el uso de la reivindicación 1, en donde dichas células de perfusato comprenden al menos alrededor de 5% células asesinas naturales placentarias intermedias CD56+, CD16' que expresan uno o más de los microARNs hsa-miR-1, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-m¡R-32c, hsa-m¡R-326, hsa-m¡R-337, hsa-m¡R-497, hsa-m¡R-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR- 517c, hsa-m¡R-518a, hsa-m¡R-518e, hsa-m¡R-519d, hsa-m¡R-52g, hsa-miR-52h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa- m¡R-618, o hsa-m¡R-99a a un nivel detectablemente más alto que las células asesinas naturales de la sangre periférica.

3. Las células nucleadas humanas del perfusato placentario para el uso de la reivindicación 2, en donde dichas células CD56+, CD16' expresan uno o más de proteína de aminopeptidasa N, proteína de apolipoproteína E, proteína 1 que interactúa con atrofina-1, proteína inx-3 de inexina, proteína del precursor de integrina alfa-2, precursor de integrina beta-5, proteína del precursor de glicoproteína de la superficie de células madre GP49B, o proteína del receptor 1 de rianodina; y en donde dichas células CD56+, CD16" no expresan una o más proteínas precursoras del receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos, proteína símil nucleótido 4 asociado por inmunidad, proteína del precursor de integrina alfa-L, proteína del precursor beta 2 de integrina, proteína del precursor de integrina beta 4, proteína del precursor de transglicosilada D de mureína lítica unida a la membrana, proteína 8 relacionada con la proteína que se une a oxiesterol, o proteína precursora de perforina 1.

4. Las células nucleadas humanas del perfusato placentario para el uso de la reivindicación 1, en donde dichas células de perfusato se usan en una proporción de alrededor de 5 células de perfusato por célula tumoral.

5. Las células nucleadas humanas del perfusato placentario para el uso de la reivindicación 1, en donde dichas células de perfusato se usan en una proporción de alrededor de 1 las células de perfusato por célula tumoral.

6. Las células nucleadas humanas del perfusato placentario para el uso de la reivindicación 1 a 5, en donde el tumor es cáncer de la sangre, o en donde el tumor es un tumor sólido, o en donde el tumor es principalmente carcinoma ductal, leucemia, leucemia de células T agudas, llnfoma mieloide crónica (CML), leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica (CML), carcinoma de pulmón, adenocarclnoma de colon, linfoma histiocítico, mieloma múltiple, carcinoma colo-rectal, adenocarclnoma colo-rectal, o retinoblastoma.

7. Células asesinas naturales placentarias Intermedias humanas CD56+, CD16' para usar en un método para el tratamiento de un tumor en un Individuo, en donde dichas células asesinas naturales intermedias placentarias expresan uno o más de los microARNs hsa-mlR-1, hsa-mlR-127, hsa-miR-211, hsam¡R-32c, hsa-miR-326, hsa- m¡R-337, hsa-m¡R-497, hsa-m¡R-512-3p, hsa-m¡R-515-5p, hsam¡R-517b, hsa-m¡R-517c, hsa-m¡R-518a, hsa-miR- 518é, hsa-m¡R-519d, hsa-m¡R-52g, hsam¡R-52h, hsa-mlR-564, hsa-miR-566, hsa-m¡R-618, o hsa-miR-99a a un nivel detectablemente más alto que las células asesinas naturales de la sangre periférica.

8. Las células asesinas naturales placentarias Intermedias humanas CD56+, CD16' para el uso de la reivindicación 7, en donde dichas células asesinas naturales placentarias intermedias se contactan con un compuesto modulador ¡nmunológico en una cantidad y durante un tiempo suficiente para dichas células asesinas naturales placentarias Intermedias para expresar detectablemente más granzima B que un número equivalente de células asesinas naturales placentarias intermedias que no se contactan con dicho compuesto inmunomodulador, en donde dicho compuesto modulador ¡nmunológico es lenalidomida o pomalidomida.

9. Las células asesinas naturales placentarias Intermedias humanas CD56+, CD16' para el uso de la reivindicación 7, en donde dichas células asesinas naturales placentarias intermedias se contactan con un compuesto modulador ¡nmunológico en una cantidad y durante un tiempo suficiente para que dichas células asesinas naturales intermedias placentarias exhiban detectablemente más cltotoxlcldad hacia dichas células tumorales que un número equivalente de células asesinas naturales placentarias Intermedias que no se contactan con dicho compuesto modulador ¡nmunológico, en donde dicho compuesto modulador ¡nmunológico es lenalidomida o pomalidomida.

1. Las células asesinas naturales placentarias Intermedias humanas CD56+, CD16' para el uso de la reivindicación 8 o 9, en donde dichas células asesinas naturales placentarias intermedias expresan uno o más de BAX, CCL5, CD68, CD8A, CSF2, FAS, GUSB o IL2RA a un nivel más alto que un número equivalente de células asesinas naturales placentarias intermedias que no se contactan con dicha lenalidomida o pomalidomida.

11. Las células asesinas naturales placentarias Intermedias humanas CD56+, CD16' para el uso de la

reivindicación 8 o 9, en donde dichas células asesinas naturales placentarias intermedias expresan uno o más de BAX, CCL2, CCL3, CCL5, CSF1, CSF2, ECE1, FAS, GNLY, GUSB, GZMB, IL1A, IL2RA, IL8, IL1, LTA, PRF1, PTGS2, SKI, o TBX21 a un nivel más alto que un número equivalente de células asesinas naturales placentarias Intermedias que no se contactan con dicha lenalldomlda o pomalidomida.

12. Las células asesinas naturales placentarias intermedias humanas CD56+, CD16' para el uso de la reivindicación 7 to 11, en donde el tumor es cáncer de la sangre, o en donde el tumor es un tumor sólido, o en donde el tumor es principalmente carcinoma ductal, leucemia, leucemia de células T agudas, linfoma mieloide crónica (CML), leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica (CML), carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon, linfoma histiocítico, mieloma múltiple, carcinoma colo-rectal, adenocarcinoma colo-rectal, o retinoblastoma.

13. Células asesinas naturales combinadas para usar en un método de tratamiento de un tumor en un individuo, en donde dichas células asesinas naturales combinadas comprenden CD56+, CD16' células asesinas naturales placentarias intermedias aisladas del perfusato placentario y células asesinas naturales aisladas de la sangre del cordón umbilical, en donde dicha sangre del cordón umbilical se aísla de la placenta de la cual se obtiene dicho perfusato placentario, y en donde dichas células asesinas naturales placentarias intermedias expresan uno o más de los microARNs hsa-m¡R-1, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-m¡R-32c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa- miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsamiR- 519d, hsa-m¡R-52g, hsa-m¡R-52h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618, o hsa-miR-99a a un nivel detectablemente más alto que las células asesinas naturales de la sangre periférica.

14. Las células asesinas naturales placentarias intermedias humanas CD56+, CD16' para el uso de la reivindicación 7 o las células asesinas naturales combinadas para el uso de la reivindicación 13, en donde dichas células asesinas naturales placentarias intermedias comprenden:

un número detectablemente más alto de células asesinas naturales CD3'CD564CD16' que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica;

un número detectablemente más bajo de CD3'CD56+CD16+ células asesinas naturales que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica;

un número detectablemente más alto de células asesinas naturales CD3'CD56+KIR2DL2/L3+ que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica;

un número detectablemente más bajo de células asesinas naturales CD3CD56 SKp46+ que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica;

un número detectablemente más alto de células asesinas naturales CD3"CD56"SKp3+ que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica;

un número detectablemente más alto de células asesinas naturales CD3"CD56+2B4+ que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica; o

un número detectablemente más alto de células asesinas naturales CD3"CD56+CD94+ que un número equivalente de células asesinas naturales de la sangre periférica.

15. Las células asesinas naturales combinadas para el uso de la reivindicación 13 o 14, en donde el tumor es cáncer de la sangre, o en donde el tumor es un tumor sólido, o en donde el tumor es principalmente carcinoma ductal, leucemia, leucemia de células T agudas, linfoma mieloide crónica (CML), leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica (CML), carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon, linfoma histiocítico, mieloma múltiple, carcinoma colo-rectal, adenocarcinoma colo-rectal, o retinoblastoma.