Sistemas y métodos para el análisis automatizado de células y tejidos.

Un método puesto en práctica por ordenador para localizar y cuantificar un biomarcador particular en muestras de tejido que contienen células,

y el método comprende:

a) usar un dispositivo óptico de formación de imágenes para obtener:

i) una primera imagen de una célula con una primera tinción que es selectiva para una primera área definida dentro de la célula;

ii) una segunda imagen de la célula con una segunda tinción que es selectiva para un biomarcador; y

iii) una tercera imagen de la célula con una tercera tinción que es selectiva para una segunda área definida dentro de la célula, en la que cada imagen está compuesta de localizaciones de píxeles;

b) leer la intensidad de píxel en cada localización de píxel de la primera imagen y la tercera imagen y comparar cada valor de intensidad con un valor de intensidad umbral predeterminado;

c) asignar cada localización de píxel en la primera imagen y la tercera imagen a la primera área definida, la segunda área definida, o una tercera área definida, en el que, para cada localización de píxel, si el valor de intensidad de píxel en la localización de píxel solamente en la primera imagen es mayor que el valor de intensidad umbral respectivo, la localización de píxel se asigna a la primera área definida, si el valor de intensidad de píxel en la localización de píxel solamente en la tercera imagen es mayor que el valor de intensidad umbral respectivo, la localización de píxel se asigna a la segunda área definida, si los valores de intensidad de píxel en la localización de píxel tanto en la primera imagen como en la tercera imagen están por debajo de los valores de intensidad umbral respectivos, la localización de píxel se asigna a la tercera área definida, y si los valores de intensidad de píxel en la localización de píxel tanto en la primera imagen como en la tercera imagen son mayores que los valores de intensidad umbral respectivos, los valores de intensidad de píxel se comparan y la localización de píxel se asigna al área definida que corresponde a la imagen que tiene el mayor valor de intensidad de píxel en la localización de píxel;

d) determinar la cantidad de intensidad de la primera área definida incorrectamente asignada a la segunda área definida y la cantidad de intensidad de la segunda área definida incorrectamente asignada a la primera área definida y reasignar las localizaciones de píxeles a la primera área definida o la segunda área definida respecto de una proporción ponderada de intensidad de la primera área definida respecto de la segunda área definida, y la ponderación se determina mediante un factor que se incrementa de manera iterativa hasta que la cantidad de localizaciones de píxeles incorrectamente asignadas es menor del 5%;

e) comparar la segunda imagen con la primera y la tercera imágenes para identificar las localizaciones de píxeles en la segunda imagen que están dentro de la primera área definida o la segunda área definida; y

f) sumar los valores de intensidad de las localizaciones de píxeles en la segunda imagen asignadas a áreas definidas similares para localizar y cuantificar así el biomarcador en las muestras de tejido que contienen células.

Sistemas y métodos para el análisis automatizado de células y tejidos

1. Antecedentes de la invención

La tecnología de mlcromatrices de tejidos ofrece la oportunidad de realizar análisis de alto rendimiento de muestras de tejidos (Konen, J. et al., Nat. Med. 4:844-7 (1998); Kallionleml, O.P. et al., Hum. Mol. Genet. 1:657-62, (21); Rlmm, D.L. et al., Cáncer J. 7:24-31 (21)). Por ejemplo, la capacidad de llevar a cabo rápidamente estudios a gran escala mediante el uso de micromatrices de tejidos puede proporcionar información crucial para identificar y validar objetivos farmacológicos / marcadores de pronóstico (p.ej. receptor de estrógenos (ER) y HER2/neu) y compuestos terapéuticos candidatos.

El análisis cuantitativo automatizado de muestras de tejidos en mlcromatrices, sin embargo, presenta varios retos, que Incluyen la heterogeneidad de los cortes de tejido, la localización subcelular de la tinción, y la presencia de señales de fondo. Por ejemplo, dependiendo del tipo de tumor o corte de tejido que se analiza, el área de interés puede representar prácticamente toda la muestra, o solamente un pequeño porcentaje. Por ejemplo, un carcinoma pancreático o carcinoma lobulillar de mama con una respuesta desmopláslca sustancial puede mostrar un tejido estromal que representa un gran porcentaje del área total. SI el objetivo del ensayo es determinar la expresión de un marcador determinado en las células epiteliales, se debe usar un protocolo que estudie solamente esa región. El protocolo no solamente debe poder seleccionar la región de interés, sino también normalizarla, de forma que la lectura del nivel de expresión de cualquier área determinada se pueda comparar con el de otras áreas. La localización subcelular presenta retos similares. Las comparaciones de tinciones nucleares o membranosas, por ejemplo, son bastante diferentes de las de la tinción citoplásmica total.

Se han usado ciertos métodos (que incluyen la microscopía confocal y la microscopía de convolución / deconvolución) para cuantificar la expresión de proteínas a nivel celular (o subcelular) dentro de un único campo de gran aumento (Robinson, J.P. Methods Cell. Biol. 63:89-16 (21); Shaw, P. Histochem. J. 26:687-94 (1994)). Sin embargo, éstas son técnicas computacionalmente intensivas y laboriosas, que funcionan con múltiples Imágenes en serle. Como resultado, el estándar actual para el análisis de mlcromatrices de tejidos, como los cortes de tejidos, es el análisis convencional basado en patólogos y la clasificación de la muestra según una escala.

La mayoría de biomarcadores exhiben una distribución paramétrica (normal, "acampanada"), y por lo tanto la mejor forma de analizarlos es mediante una escala continua (p.ej., a 1). Desafortunadamente, la observación manual tiende a ser nominal (p.ej. 1+, 2+, 3+), principalmente porque el ojo humano es incapaz de distinguir con precisión diferencias sutiles de intensidad de tinción. Se han desarrollado varios métodos para traducir las observaciones manuales nominales hasta una escala continua. El primero de éstos es el H-Score, en el que el porcentaje de células teñidas positivamente ( a 1) se multiplica por la intensidad de la tinción (p.ej., a 3) para producir una escala teóricamente continua ( a 3). Sin embargo, la incapacidad de detectar diferencias sutiles de intensidad de tinción, en particular en los extremos bajo y alto de la escala, así como la tendencia a redondear los índices (p.ej., 5% a 3+ para un índice de 15, frente a 47% a 3+ para un índice de 141), limita la eficacia del H-Score.

El documento US 6.151.45 describe un sistema y método para clasificar muestras celulares. El sistema y método es para la determinación de la cantidad de marcador que identifica un precipitado en una muestra celular en un portaobjetos de microscopio.

El documento US 6.215.892 describe un método y aparato para el análisis celular automatizado de muestras biológicas, que escanea automáticamente a bajo aumento para adquirir imágenes que se analizan para determinar objetivos celulares candidatos de interés.

Agard D A: "Optical Sectioning Microscopy: Cellular Architecture in Three Dimensions" Annual Review of Biophysics and Bioengneering, Annual Reviews Inc., Palo Alto, CA, EE.UU., vol. 13, 1 de enero de 1984, páginas 191-219, ISSN: 883-9182 se refiere al análisis de muestras biológicas en tres dimensiones.

El documento US 6.26.174 describe un sistema y método para detectar automáticamente células malignas y células que tienen cambios asociados a malignidad.

El documento WO 97/4418 describe un método para segmentar imágenes resueltas espectralmente. El método comprende la adquisición de tres imágenes de la misma escena micrográfica.

El documento WO /62247 describe un método para el análisis automatizado de imágenes de una muestra biológica mediante reconstrucción histológica, para analizar una muestra biológica que se ha teñido consecutivamente mediante un método de hibridación in situ o un método de inmunohistoquímica o una tinción de ácidos nucleicos, y con una contratinción.

Se necesitan sistemas y métodos automatizados para analizar rápidamente tejidos, que incluyen micromatrices de tejidos, que permitan la identificación y localización de biomarcadores identificados en los tejidos y otras muestras que contienen células.

2. Sumario de la invención

En un aspecto, la invención presenta sistemas y métodos para analizar rápidamente muestras que contienen células para localizar y cuantificar biomarcadores particulares dentro de las células. En una realización, el método se pone en práctica mediante un ordenador y superpone una imagen del biomarcador con una imagen de un área definida por el usuario dentro de la célula para determinar si el biomarcador está dentro del área definida por el usuario.

En otro aspecto, la invención presenta un algoritmo que facilita el análisis óptico de una matriz de muestras biológicas, a pesar de las irregularidades de la imagen, distorsiones, topologías variables, y la ausencia de uno o más elementos.

El análisis de las muestras de pacientes según los sistemas y procesos descritos en la presente memoria puede ser útil para el diagnóstico (p.ej. para identificar los pacientes que tienen una enfermedad particular, que han sido expuestos a una toxina particular o que están respondiendo bien a un agente terapéutico particular o transplante de órganos) y para el pronóstico (p.ej. para identificar los pacientes que es probable que desarrollen una enfermedad particular, que respondan bien a un agente terapéutico particular o que vayan a recibir un transplante de un órgano particular). A medida que se identifican nuevos y mejores marcadores de enfermedades en la era post-genómica, los presentes procesos descritos, que no solamente cuantifican los marcadores, sino que también determinan su localización relativa dentro de una célula, tendrán una aplicabilidad incrementada.

El análisis automatizado de preparaciones que contienen células, como se describe en la presente memoria, puede proporcionar una determinación rápida del beneficio pronóstico de los biomarcadores. Además, estas técnicas automatizadas pueden identificar asociaciones que en general no se revelan mediante el uso de las técnicas manuales. Además, el análisis automatizado puede distinguir mejor las diferencias sutiles de intensidad de tinción, en particular en los extremos superior e inferior. La capacidad de detectar una expresión de nivel bajo y distinguirla de la ausencia de expresión puede proporcionar una información pronostica importante. Además, el análisis de la distribución subcelular de ciertos biomarcadores puede dilucidar asociaciones previamente no reconocidas con la supervivencia de los pacientes.

Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.

3. Descripción de las figuras

La FIG. 1(A-D) muestra diferentes imágenes monocromáticas de un carcinoma de colon tomadas después de teñir con marcadores fluorescentes y combinarlas en una única imagen en color como sigue: DAPI (para visualizar los núcleos, azul), anti-citoqueratlna (para distinguir los elementos tumorales de los no tumorales, verde), y anti-alfa- catenina (para visualizar las membranas celulares, rojo).

La FIG. 2(A-D) muestra una comparación de regresión de índices automatizados y basados en patólogos de los niveles de receptores de estrógenos.

La FIG. 3 es un diagrama de flujo de un método para identificar y explicar la localización relativa de los cortes en una matriz.

La FIG. 4 es un diagrama de flujo de un proceso... [Seguir leyendo]

1. Un método puesto en práctica por ordenador para localizar y cuantlflcar un blomarcador particular en muestras de tejido que contienen células, y el método comprende:

a) usar un dispositivo óptico de formación de imágenes para obtener:

i) una primera imagen de una célula con una primera tinción que es selectiva para una primera área definida dentro de la célula;

ii) una segunda imagen de la célula con una segunda tinción que es selectiva para un biomarcador; y

iii) una tercera imagen de la célula con una tercera tinción que es selectiva para una segunda área definida dentro de la célula, en la que cada imagen está compuesta de localizaciones de píxeles;

b) leer la intensidad de píxel en cada localización de píxel de la primera imagen y la tercera imagen y comparar cada valor de intensidad con un valor de intensidad umbral predeterminado;

c) asignar cada localización de píxel en la primera imagen y la tercera imagen a la primera área definida, la

segunda área definida, o una tercera área definida, en el que, para cada localización de píxel, si el valor de

intensidad de píxel en la localización de píxel solamente en la primera imagen es mayor que el valor de

intensidad umbral respectivo, la localización de píxel se asigna a la primera área definida, si el valor de

intensidad de píxel en la localización de píxel solamente en la tercera imagen es mayor que el valor de

intensidad umbral respectivo, la localización de píxel se asigna a la segunda área definida, si los valores de intensidad de píxel en la localización de píxel tanto en la primera imagen como en la tercera imagen están por debajo de los valores de intensidad umbral respectivos, la localización de píxel se asigna a la tercera área definida, y si los valores de intensidad de píxel en la localización de píxel tanto en la primera imagen como en la tercera imagen son mayores que los valores de intensidad umbral respectivos, los valores de intensidad de píxel se comparan y la localización de píxel se asigna al área definida que corresponde a la imagen que tiene el mayor valor de intensidad de píxel en la localización de píxel;

d) determinar la cantidad de intensidad de la primera área definida incorrectamente asignada a la segunda área definida y la cantidad de intensidad de la segunda área definida incorrectamente asignada a la primera área definida y reasignar las localizaciones de píxeles a la primera área definida o la segunda área definida respecto de una proporción ponderada de intensidad de la primera área definida respecto de la segunda área definida, y la ponderación se determina mediante un factor que se incrementa de manera iterativa hasta que la cantidad de localizaciones de píxeles incorrectamente asignadas es menor del 5%;

e) comparar la segunda imagen con la primera y la tercera imágenes para identificar las localizaciones de píxeles en la segunda imagen que están dentro de la primera área definida o la segunda área definida; y

f) sumar los valores de intensidad de las localizaciones de píxeles en la segunda imagen asignadas a áreas definidas similares

para localizar y cuantificar así el biomarcador en las muestras de tejido que contienen células.

2. El método de la reivindicación 1, en el que cada área definida se selecciona del grupo que consiste en un

núcleo celular, un citoplasma, una membrana nuclear, una membrana celular, una mitocondria, un retículo

endoplásmico, un peroxisoma y un lisosoma.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un péptido, uno ácido nucleico, un lípido o un carbohidrato.

4. El método de la reivindicación 1, en el que cada una de la primera, la segunda y la tercera tinción comprende un fluoróforo.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la cuantificación del biomarcador presente dentro de la primera o la segunda áreas definidas comprende sumar los valores de intensidad de la segunda tinción en las localizaciones de píxeles dentro de tal área definida y dividir la suma por el número de píxeles en tal área definida.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el tejido tiene un grosor de alrededor de cinco mieras.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la primera área definida es una membrana celular y la segunda área

definida es un núcleo celular.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de tejido es un corte de tejido fijado.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la primera o la tercera tinción reacciona con un marcador que se selecciona del grupo que consiste en citoqueratina, beta-catenina, y alfa-catenina.

1. El método de la reivindicación 1, en el que al menos una de la primera, la segunda o la tercera tinción comprende un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Cy3 y Cy-5- tlramlda.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en Her-2/neu, receptor de estrógenos, y receptor de progesterona.

12. El método de la reivindicación 1, en el que se aplica una máscara a la primera, la segunda y la tercera imágenes.

13. El método de la reivindicación 1, en el que la primera o la tercera tinción se selecciona del grupo que consiste en anti-citoqueratina, anti-beta-catenina, anti-alfa-catenina, y anti-vimentina.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la segunda tinción se selecciona del grupo que consiste en anti-Her- 2/neu, anti-receptor de estrógenos, anti-receptor de progesterona y anti-EGFR.

15. El método de la reivindicación 1, que comprende además después de la etapa (a) pero antes de la etapa (b) llevar a cabo una etapa de pseudo-deconvolución que comprende:

1) obtener una imagen desenfocada de cada una de la primera, la segunda y la tercera tinción en la muestra de tejido en la que cada imagen tiene un valor de intensidad desenfocada para cada localización de píxel; y

2) restar el valor de intensidad desenfocada para cada localización de píxel del valor de intensidad en tal localización de píxel en la primera, la segunda y la tercera imágenes de la etapa (a);

para obtener así una imagen procesada para cada tinción, corregida para el fondo.

16. El método de la reivindicación 1, en el que el dispositivo óptico de formación de imágenes es un microscopio óptico vertical o invertido.

17. Un sistema para localizar y cuantificar un biomarcador particular en muestras de tejidos que contienen células, y el sistema comprende:

a) un dispositivo óptico de formación de imágenes para obtener una vista aumentada de la muestra de tejido;

b) medios para usar el dispositivo óptico de formación de imágenes para obtener:

i) una primera imagen de una célula con una primera tinción que es selectiva para una primera área definida dentro de la célula;

ii) una segunda imagen de la célula con una segunda tinción que es selectiva para un biomarcador; y

iii) una tercera imagen de la célula con una tercera tinción que es selectiva para una segunda área definida dentro de la célula, en la que cada imagen está compuesta de localizaciones de píxeles;

c) medios para leer la intensidad de píxel en cada localización de píxel de la primera imagen y la tercera imagen y comparar cada valor de intensidad con un valor de intensidad umbral predeterminado;

d) medios para asignar cada localización de píxel en la primera imagen y la tercera imagen a la primera área definida, la segunda área definida, o una tercera área definida, en el que, para cada localización de píxel, si el valor de intensidad de píxel en la localización de píxel solamente en la primera imagen es mayor que el valor de intensidad umbral respectivo, la localización de píxel se asigna a la primera área definida, si el valor de intensidad de píxel en la localización de píxel solamente en la tercera imagen es mayor que el valor de intensidad umbral respectivo, la localización de píxel se asigna a la segunda área definida, si los valores de intensidad de píxel en la localización de píxel tanto en la primera imagen como en la tercera imagen están por debajo de los valores de intensidad umbral respectivos, la localización de píxel se asigna a la tercera área definida, y si los valores de intensidad de píxel en la localización de píxel tanto en la primera imagen como en la tercera imagen son mayores que los valores de intensidad umbral respectivos, los valores de intensidad de píxel se comparan y la localización de píxel se asigna al área definida que corresponde a la imagen que tiene el mayor valor de intensidad de píxel en la localización de píxel;

e) medios para determinar la cantidad de intensidad de la primera área definida incorrectamente asignada a la segunda área definida y la cantidad de intensidad de la segunda área definida Incorrectamente asignada a la primera área definida y reasignar las localizaciones de píxeles a la primera área definida o la segunda área definida respecto de una proporción ponderada de intensidad de la primera área definida respecto de la segunda área definida, y la ponderación se determina mediante un factor que se Incrementa de manera Iterativa hasta que la cantidad de localizaciones de píxeles Incorrectamente asignadas es menor del 5%;

f) medios para comparar la segunda Imagen con la primera y la tercera Imágenes para identificar las

localizaciones de píxeles en la segunda imagen que están dentro de la primera área definida o la segunda área definida; y

g) medios para sumar los valores de intensidad de las localizaciones de píxeles en la segunda imagen asignadas a áreas definidas similares

para localizar y cuantificar así el biomarcador en las muestras de tejido que contienen células.

18. El sistema de la reivindicación 17, en el que el dispositivo óptico de formación de imágenes es un microscopio óptico vertical o invertido.

Figura 1

K3

O

<Q

C

Q)

N>

Indice automatizado Matriz 2 (x 1)

Indice basado en patólogos Matriz 2

Indice auto. Matriz 1 (x 1)

U Vi «

B1

Eliminar cortes de tamaños atípicos

B2

B3

_

Escanear imagen con máscara

B4v/~

Determinar dónde la máscara cubre un área con la intensidad media de píxel más alta

Ajustar la intensidad de píxel a cero en el área

T

Imagen completa procesada

N

A

v4

B5

B6

Identificar los puntos de referencia en los cortes histológicos identificados

Conectar los puntos de referencia de los cortes histológicos identificados

B7\^

Definir las coordenadas para los puntos de referencia e intersecciones entre conexiones

FIG. 3

FIG. 4