Procedimiento de reducción de derivados de cinamaldehído usando enoato reductasas.

procedimiento catalizado enzimáticamente de producción de un compuesto aldehído de fórmula general I**Fórmula**

en la que

R1 y R2 independientemente el uno del otro representan alquilo opcionalmente sustituido,

lineal o ramificado, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alqueniloxi; -H, -OH, -SH, -halógeno, - NH2, o -NO2; o R1 y R2 representan conjuntamente un grupo de fórmula -O-R4-O-, en la que R4 representa un grupo alquileno o alquenileno opcionalmente sustituido; y R3 representa alquilo o alcoxi;

cuyo procedimiento comprende:

a) reducir enzimáticamente un compuesto de fórmula II**Fórmula**

en la que

R1, R2 y R3 son tal como se han definido anteriormente,

en un medio acuoso de reacción que comprende una proporción de un 5 a un 40 % en volumen como un cosolvente al menos un compuesto de éter no simétrico de fórmula III**Fórmula**

en la que

uno de los restos R5 y R6 es un grupo alquilo C3 - C8 ramificado, y el otro es un grupo alquilo C1 - C6 y además que contiene al menos una enzima reductasa y al menos un cofactor;

en el que dicha reductasa se selecciona entre el grupo que consiste en

i) OYE1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, o una secuencia idéntica en al menos un 60 % con dicha SEC ID Nº: 1 y que es capaz de hidrogenar un compuesto de fórmula II en la posición C2/C3;

ii) OYE2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, o una secuencia idéntica en al menos un 60 % con dicha SEC ID Nº: 2 y que es capaz de hidrogenar un compuesto de fórmula II en la posición C2/C3;

iii) OYE3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, o una secuencia idéntica en al menos un 60 % con dicha SEC ID Nº: 3 y que es capaz de hidrogenar un compuesto de fórmula II en la posición C2/C3; y

b) opcionalmente aislar dicho compuesto de fórmula I en forma de un estereoisómero básicamente puro o como una mezcla de estereoisómeros.

Procedimiento de reducción de derivados de cinamaldehído usando enoato reductasas La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento catalizado enzimáticamente de producción de aldehídos aromáticos asimétricos en un medio de reacción acuoso que contiene determinados cosolventes orgánicos.

Antecedentes de la invención Debido a su volatilidad y a sus propiedades olfativas, los aldehídos constituyen importantes principios activos en aplicaciones de perfumes y aromas (a) C. Chapuis, D. Jacoby, Appl. Catal. A: Gen. 2001, 221, 93-117; b) D. Pybus, C. Sell, The chemistr y of fragrances, RSC Paperbacks, Royal Society of Chemistr y , Cambridge, 1999) . Dado que los enantiómeros de aldehídos α-y Ã?-sustituidos a menudo difieren considerablemente en el olor (a) A. Abate, E. Brenna, C. Fuganti, F. G. Gatti, S. Serra, Chem. Biodivers. 2004, 1, 1888-1898; b) L. Doszczak, P. Kraft, H. P. Weber, R. Bertermann, A. Triller, H. Hatt, R. Tacke, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 3367-3371; c) E. Brenna, C. Fuganti, S. Serra, Tetrahedron: Asymmetr y 2003, 14, 1-42) , a menudo se requiere su aplicación en forma no racémica. Aunque los aldehídos Ã?-sustituidos son quiralmente estables, los análogos α-sustituidos son propensos a la racemización, que requiere procedimientos sofisticados para su preparación. Entre ellos, la desimetrización de enales conjugados a través de hidrogenación simétrica es el procedimiento de elección (L. A. Saudan, Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1309-1319) . Aunque se han informado numerosos protocolos que usan homogéneo modificado quiralmente (metal de transición) que contiene catalizadores (Por ejemplo véase: a) S. Akutagawa, Appl. Catal. A: Gen. 1995, 128, 171-207; b) S. Bovo, A. Scrivanti, M. Bertoldini, V. Beghetto, O. Matteoli, Synthesis 2008, 25472550; c) W. S. Knowles, R. Noyori, Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1238-1239; d) A. J. Minnaard, B. L. Feringa, L. Lefort, J. G. de Vries, Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1267-1277) , organocatalizadores independientes de metales para la reducción de enales a expensas de un mimético de nicotinamida (â?éster de Hantzschâ?) como fuente de hidruro se desarrollaron más recientemente (a) J. W. Yang, M. T. H. Fonseca, N. Vignola, B. List, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 108-110; b) H. Adolfsson, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3340-3342; c) S. G. Ouellet, A. M. Walji, D. W. C. MacMillan, Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1327-1339; d) K. Akagawa, H. Akabane, S. Sakamoto, K. Kudo, Tetrahedron: Asymmetr y 2009, 20, 461-466) . Hasta la fecha, los catalizadores heterogéneos de superficie modificada quiralmente no son competitivos (a) D. J. Watson, R. J. B. R. J. Jesudason, S. K. Beaumont, G. Kyriakou, J. W. Burton, R. M. Lambert, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14584-14589; b) A. Tungler, E. Sipos, V. Hada, Curr. Org. Chem. 2006, 10, 1569-1583) . Como una alternativa a la diversidad de procedimientos quimiocatalíticos, se ha concebido biorreducción mediante el uso de diversos tipos de enzimas redox (S. Serra, C. Fuganti, E. Brenna, Trends Biotechnol. 2005, 23, 193-198) . Con el fin de eludir la purificación tediosa de proteínas y el reciclado de cofactores externos, se usaron células microbianas enteras â?" levadura de panadero más importante â?" para la reducción de enales. Debido a la presencia de eno-y carbonil-reductasas conflictivas, la biorreducción quimio-y estereoselectiva de enales fue imposible, debido a que la reducción de carbonilo no deseada siempre anulaba la reducción del enlace C=C deseado, causando por lo tanto la supresión de sustrato y de producto a través de formación de los alcoholes alílicos y/o saturados correspondientes (a) M. Majeric, A. Avdagic, Z. Hamersak, V. Sunjic, Biotechnol. Lett. 1995, 17, 1189-1194; C. Fuganti, S. Serra, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 2000, 3758-3764; c) P. Dâ?Arrigo, C. Fuganti, G. Pedrocchi-Fantoni, S. Servi, Tetrahedron 1998, 54, 15017-15026; d) G. Fronza, C. Fuganti, P. Grasselli, L. Majori, G. Pedrocchi-Fantoni, F. Spreafico, J. Org. Chem. 1982, 47, 3289-3296; e) G. Fronza, C. Fuganti, M. Pinciroli, S. Serra, Tetrahedron: Asymmetr y 2004, 15, 3073-3077; f) V. Sunjic, M. Majeric, Z. Hamersak, Croat. Chem. Acta 1996, 69, 643-660) .

No fue hasta recientemente que las eno-reductasas estables en oxígeno de la familia de Enzimas Old Yellow llegaron a estar disponibles en cantidades suficientes que permitieran la biorreducción quimio y estereoselectiva de enlaces C=C activados en enonas y enales al dejar restos de C=O intactos (para una revisión véase: a) R. Stuermer, B. Hauer, M. Hall, K. Faber, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11, 203-213; b) S. K. Padhi; D. J. Bougioukou, J. D. Stewart, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 3271-3280; J. F. Chaparro-Riggers, T. A. Rogers, E. Vazquez-Figueroa, K.

M. Polizzi, A. S. Bommarius, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1521-1531; d) M. Kataoka, A. Kotaka, R. Thiwthong, M. Wada, S. Nakamori, S. Shimizu, J. Biotechnol. 2004, 114, 1-9. Para la biorreducción estereoselectiva de αmetilcinamaldehído usando las enzimas OYE 1-3 y el isopropanol cosolvente véase: A. Müller, B. Hauer, B. Rosche, Biotechnol. Bioeng. 2007, 98, 22-29) . Alentados por los resultados recientes (a) M. Hall, C. Stueckler, W. Kroutilo, P. Macheroux, K. Faber, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 3934-3937; b) M. Hall, C. Stueckler, H. Ehammer, E. Pointner, G. Oberdorfer, K. Gruber, B. Hauer, R. Stuermer, W. Kroutilo, P. Macheroux, K. Faber, Adv. Synth. Catal. 2008, 350, 411-418; c) M. Hall, C. Stueckler, B. Hauer, R. Stuermer, T. Friedrich, M. Breuer, W. Kroutilo, K. Faber, Eur. J. Org. Chem. 2008, 1511-1516.) , los inventores han investigado la aplicación de estas enzimas para la preparación de derivados de α-metil dihidrocinamaldehído no racémicos usados en aplicaciones de perfumería (para la biorreducción estereoselectiva de α-metilcinamaldehído usando las enzimas OYE 1-3 y el isopropanol cosolvente véase: A. Müller, B. Hauer, B. Rosche, Biotechnol. Bioeng. 2007, 98, 22-29) .

Aún existe la necesidad de procedimientos enzimáticos mejorados para preparar formas enantioméricas de derivados de cinamaldehído.

Sumario de la invención Este problema se resolvió, sorprendentemente, proporcionando un procedimiento catalizado enzimáticamente tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En particular, derivados de cinamaldehído no racémicos, tal como por ejemplo derivados de αmetildihidrocinamaldehído, usados como principios olfativos en perfumes (Lilialâ¢, Helionalâ¢) se obtuvieron de acuerdo con la invención a través de reducción enzimática de los precursores correspondientes (es decir precursor de cinamaldehído) usando diferentes eno-reductasas clonadas y sobre expresadas. Las OYE 1-3 proporcionan (S) aldehídos con hasta un e.e. de un 97 % en condiciones de reacción optimizadas en presencia de t-butil metil éter como cosolvente. El resultado estereoquímico de la reducción de α-metilcinamaldehído usando NCR y OYE1-3 [que anteriormente se informó que era (R) ] se corrigió inequívocamente para que fuera (S) .

Descripción de las figuras:

Figura 1. Dependencia de la velocidad de reacción y de la estereoselectividad sobre la proporción de cosolvente orgánico (t-BuOMe, v:v) en la reducción de 1a usando OYE3.

Descripción detallada de la invención 1. Realizaciones específicas La presente invención, en particular, se refiere a las siguientes realizaciones:

En una primera realización, la presente invención proporciona un procedimiento catalizado enzimáticamente de producción, en particular la síntesis asimétrica, de un compuesto aldehído de fórmula general I

** (Ver fórmula) **

en la que R1 y R2 independientemente el uno del otro representan alquilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, tal como alquilo C1-C8 o C1-C6; alquenilo, tal como alquenilo C2-C8 o C2-C6; alquinilo, tal como alquinilo C2-C8

o C2-C6; alcoxi, tal como alcoxi C1-C8 o C1-C6; alqueniloxi, tal como alqueniloxi C2-C8 o C2-C6; -H, -OH, -SH, halógeno, tal como F, Cl o Br; -NH2, o -NO2; en particular, H o alquilo lineal o ramificado, tal como alquilo C1-C6 o C1-C4; alquenilo, tal como alquenilo C2-C6; alquinilo, tal como alquinilo C2-C6; alcoxi, tal como alcoxi C1-C6 o C1-C4; alqueniloxi, tal como C2-C6 alqueniloxi; o más particularmente H o alquilo C3-C6 ramificado o alquenilo C3-C6;

o R1 y R2 representan conjuntamente un grupo de fórmula -O-R4-O-, en la que R4 representa un alquileno opcionalmente sustituido, tal como alquileno o alquenileno C1-C4, tal como alquenileno C2-C6 o C3-C6; y R3 representa alquilo, tal como alquilo C1-C6; o alcoxi, tal como alcoxi C1-C6, en particular alquilo C1-C4; en el que dicho compuesto, que contiene un átomo de carbono asimétrico en la posición 2, está en la configuración (R) o (S) ;

cuyo procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento catalizado enzimáticamente de producción de un compuesto aldehído de fórmula general I

** (Ver fórmula) **

en la que R1 y R2 independientemente el uno del otro representan alquilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alqueniloxi; -H, -OH, -SH, -halógeno, -NH2, o -NO2; o R1 y R2 representan conjuntamente un grupo de fórmula -O-R4-O-, en la que R4 representa un grupo alquileno o alquenileno opcionalmente sustituido; y R3 representa alquilo o alcoxi;

cuyo procedimiento comprende:

a) reducir enzimáticamente un compuesto de fórmula II

** (Ver fórmula) **

en la que R1, R2 y R3 son tal como se han definido anteriormente, en un medio acuoso de reacción que comprende una proporción de un 5 a un 40 % en volumen como un cosolvente al menos un compuesto de éter no simétrico de fórmula III

** (Ver fórmula) **

en la que uno de los restos R5 y R6 es un grupo alquilo C3 -C8 ramificado, y el otro es un grupo alquilo C1 -C6 y además 20 que contiene al menos una enzima reductasa y al menos un cofactor; en el que dicha reductasa se selecciona entre el grupo que consiste en i) OYE1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 1, o una secuencia idéntica en al menos un 60 % con dicha SEC ID Nº : 1 y que es capaz de hidrogenar un compuesto de fórmula II en la posición C2/C3;

ii) OYE2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2, o una secuencia idéntica en al menos un 60 % con dicha SEC ID Nº : 2 y que es capaz de hidrogenar un compuesto de fórmula II en la posición C2/C3; iii) OYE3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 3, o una secuencia idéntica en al menos un 60 % con dicha SEC ID Nº : 3 y que es capaz de hidrogenar un compuesto de fórmula II en la posición C2/C3;

y b) opcionalmente aislar dicho compuesto de fórmula I en forma de un estereoisómero básicamente puro o como una mezcla de estereoisómeros.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cosolvente es un t-butil alquil éter.

3. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se realiza en presencia de NADH o NADPH como cofactor.

4. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de reducción se acopla a una reacción de reciclado de cofactor.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el cofactor NAD oxidado se recicla por acoplamiento a la 40 oxidación de glucosa catalizada por la glucosa deshidrogenasa.

6. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que las enzimas implicadas están presentes en el medio de reacción en forma disuelta, dispersa o inmovilizada.

7. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de reacción se tampona a un pH en el intervalo de 6, 5 a 8, 5.

8. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura de reacción está en el intervalo de 10 a 50 º C.

** (Ver fórmula) **