Ratones cisgénicos sobreproductores de MCP-1.

Ratones cisgénicos sobreproductores de MCP-1.

La presente invención se refiere a una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1,

cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1, presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón, así como de progenies y líneas celulares derivadas. La presente invención también se refiere a la utilización de las mismas.

Ratones cisgénicos sobreproductores de MCP-1

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de animales cisgénicos y uso de los mismos. En particular, la presente invención se refiere a ratones cisgénicos que sobreproducen MCP-1 útiles en el estudio de enfermedades como por ejemplo, la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.

Antecedentes de la invención La obesidad, y por tanto, las enfermedades asociadas , especialmente aterosclerosis, esteatosis hepática , resistencia a la insulina, o diabetes, constituye el principal problema al que se enfrenta la medicina moderna. Para comprender su patobiología, los conocimientos actuales obligan a que cualquier hipótesis debe considerar los mecanismos de regulación del sistema inmune y debe, en consecuencia, dirigirse al estudio del complejo entramado de las citoquinas. De este modo, los procesos inflamatorios se hacen patentes mediante la acción concertada de numerosas citoquinas, quimiocinas, hormonas y factores de transcripción que actúan en red, de forma que la respuesta de un elemento interfiere o activa otro.

Una de las citoquinas más importantes es la quimiocina MCP-1 (del inglés monocyte chemolaclic prolein-1) que se sabe que está relacionada con la presencia concomitante de hiperlipidemia, uno de los aspectos más frecuentes en la obesidad y la arteriosclerosis. La ausencia o deficiencia de MCP-1 tiene efectos relevantes en el reclutamiento de macrófagos y en la secreción de otras citoquinas. El papel relevante de MCP-1 en la génesis de la arteriosclerosis ha sido descrita y justificada por el hecho de que la deficiencia de MCP-1 disminuye de forma significativa la presencia de aterosclerosis en ratones genéticamente modificados (MCP-1 '¡) Recientemente se han descrito trastornos en el metabolismo de la glucosa y de las lipoproteínas derivados de la ausencia de MCP-1 , es decir, parece haber una relación directa entre MCP-1 y la homeostasis energética. Datos recientes (véase, Rull A el al. Hepatic monocyte chemoattractant protein-1 is upregulated by dietar y cholesterol and contributes to liver steatosis. Cytokine 2009, 48:273-9) confirman que la ausencia de MCP-1 enlentece la progresión de la arteriosclerosis, previene la inducción de la obesidad,

evita la formación de esteatosis hepática y afecta notablemente a la resistencia a la insulina y el metabolismo hepático del colesterol.

Así pues, con el objetivo de estudiar más profundamente las bases moleculares y

fisiopatologías del proceso inflamatorio en relación con enfermedades, tales como la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis, los presentes inventores han desarrollado un ratón cisgénico con un background genético C57BL6/J sobreproductor de MCP-1 en todos los tejidos del organismo.

Hasta la fecha los estudios planteados solamente buscaban respuestas desde la deficiencia de MCP-1 , por lo que el objetivo del desarrollo de dicho ratón es estudiar el problema desde la posición contraria.

El documento US5817911 describe un animal no transgénico que sobreexpresa un gen responsable de la acumulación de monocitos y leucocitos. En particular, se indica que el transgen que se inserta expresa MCP-1 y más preferiblemente sobreexpresa MCP-1 en células epiteliales pulmonares de tipo 11. Este animal se utiliza como modelo para ensayar fármacos para el tratamiento de enfermedades que dan lugar a una acumulación elevada de monocitos y/o linfocitos.

El documento W09746664 describe un animal no humano (ratón) transgénico que expresa un transgen que codifica perlecan. Se menciona que este animal transgénico se puede aparear con otro animal transgénico que sobre produce, entre muchas otras, la proteína MCP-1.

Ninguno de los modelos planteados hasta la fecha, presenta una sobreproducción de MCP1 en todos los tejidos del organismo.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Genotipado de la cepa sobreproductora de MCP-1 (homocigoto (tgMCP-1 +1+) ; heterocigoto (tgMCP-1 +1-" y de un ratón salvaje (WT) . WM: marcador de peso molecular. Figura 2A. Concentración de MCP-1 en diferentes tejidos del modelo animal tgMCP-1 +1-, obtenidos mediante ELlSA. (TABe: Tejido adiposo blanco epididimal, TABi: Tejido adiposo blanco inguinal, TAM: Tejido adiposo marrón) . Figura 2B. Concentración de MCP-1 en suero y plasma del modelo animal tgMCP-1 +1-.

Figura 3. Control del aumento de peso y de la ingesta de alimento en un estudio de intervención dietética llevado a cabo en la cepa sobreproductora de MCP-1 de 32 semanas de edad. Figura 4. Concentraciones séricas de colesterol y triglicéridos en las distintas cepas estudiadas y con distinto tratamiento dietético a las 16 semanas de edad. Figura 5. Test de tolerancia a la glucosa en las distintas cepas y diferentes intervenciones dietéticas. Figura 6. Peso relativo de los órganos metabólicos más importantes. eWAT: tejido adiposo blanco epididimal. iWAT: tejido adiposo blanco inguinal. BAT: Tejido adiposo marrón. Figura 7. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (20x) . Se observan las imágenes según los diferentes tratamientos dietéticos y las diferentes cepas (homocigoto +/+ y heterocigoto +/-) en ratones tratados durante 16 semanas. CD =dieta Chow; HF = Dieta rica en grasas Figura 8. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (20x) . Se observan las imágenes según los diferentes tratamientos dietéticos y las diferentes cepas (homocigoto +/+ y heterocigoto +/-) en ratones tratados durante 24 semanas. CD =dieta Chow; HF = Dieta rica en grasas Figura 9. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (20x) . Se observan las imágenes según los diferentes tratamientos dietéticos y las diferentes cepas (homocigoto +/+ y heterocigoto +/-) en ratones tratados durante 32 semanas. CD =dieta Chow; HF = Dieta rica en grasas Figura 10. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (4x, 20x y 40x) . Se observan imágenes de ratones tgMCP-1 +'+ alimentados con dieta rica en grasa durante 32 semanas. Figura 11 . Cortes histológicos hepáticos en microscopía electrónica de ratones sobre productores de MCP-1 de los distintos grupos dietéticos a las 24 semanas de edad. Las flechas muestran distintas mitocondrias. A. Cepa heterocigota alimentada con una dieta normal. B. Cepa homocigota alimentada con una dieta normal. C. Cepa heterocigota alimentada con una dieta rica en grasa. D. Cepa homocigota alimentada con una dieta rica en grasa. Figura 12. Esquema del vector insertado en el Locus ROSA26. La secuencia de STOP, flanqueada por sitios se restricción 10xP, se encuentra entre el promotor (UbiC) y el gen de MCP-1 (representado por sus tres exones: 1, 2 Y 3) . Los elementos PGK, Neo y SDIS, solamente son necesarios para la selección de clones.

Descripción de la invención La presente invención se refiere a una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 (tgMCP-1 ) , cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1 , presente tanto en células 5 somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón introducido mediante transgénesis o intragénesis.

La presente invención también se refiere a una línea celular derivada de una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 (tgMCP-1 ) , cisgénica y homocigota,

sobre productores de MCP-1 , presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón introducido mediante transgénesis o intragénesis.

La presente invención también se refiere a una progenie de una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 (tgMCP-1 ) , cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1 , presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón introducido mediante transgénesis o intragénesis.

Por "animal cisgénico" o ~ratón cisgénico" se entiende en la presente invención, un 20 organismo (animal, preferiblemente ratón) que contiene en su gen ama fragmentos de AON de su misma especie pero que ha sido obtenido mediante ingeniería genética.

El ratón desarrollado en la presente invención es un ratón que además de conservar la proteína natural (wild type, cromosoma 11 ) , posee otra copia en otro locus genético (ROSA26, cromosoma 6) regulada por un potente promotor (promotor de la ubiquitina) en un background genético que es C57BU6J.

El desarrollo de la cepa de ratones de la presente invención se basa en la tecnología Cre/Lox, ampliamente utilizada en el diseño de ratones transgénicos inducibles. Los ratones 30 transgénicos inducibles son ratones en los que se puede activar la expresión de un gen de forma ubicua o en tejidos concretos, como en hígado, páncreas... [Seguir leyendo]

1. Cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1, cisgénica y homocigota, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón.

2. Línea celular derivada de una cepa de ratones según la reivindicación 1.

3. Progenie de una cepa de ratones según la reivindicación 1.

4. Utilización de una cepa de ratones según la reivindicación 1> como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.

5. Utilización de una o más líneas celulares según la reivindicación 2, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.

6. Utilización de una progenie según la reivindicación 3, como modelo para el estudio de la obesidad , la esteatosis hepática o la aterosclerosis 7. Utilización de una cepa de ratones según la reivindicación 1 en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.

8. Utilización de una o más líneas celulares según la reivindicación 2, en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.

9. Utilización de una progenie según la reivindicación 3, en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.