Purificación de anticuerpos anti-HER2.

Un método para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y contaminantes,

en el que el polipéptido es un anticuerpo que se une a HER2 y en el que los contaminantes comprenden una variedad desamidada del anticuerpo, y en donde el método comprende las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición sobre una resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado que tiene una primera concentración de sal;

(b) lavar la resina de intercambio catiónico con un tampón de lavado hasta que se mide una concentración predeterminada de proteína en el flujo a través, en donde la concentración de sal del tampón de lavado aumenta desde una segunda concentración de sal inicial que es mayor que la concentración de sal del tampón de equilibrado, a una tercera concentración final de sal;

(c) hacer pasar un volumen fijo de 0,4 a 1 volumen de columna de tampón de lavado a la tercera concentración final de sal sobre la resina de intercambio catiónico; y

(d) eluir el polipéptido de la resina de intercambio catiónico con tampón de elución que tiene una concentración de sal que es mayor que la concentración final de sal del tampón de lavado.

Purificación de anticuerpos anti-Her2

Antecedentes de la invención Campo de la invención Esta invención se refiere generalmente a purificación de proteínas. En particular, la invención se refiere a un método para purificar un polipéptido (un anticuerpo) a partir de una composición que comprende al polipéptido y al menos un contaminante usando el método de cromatografía de intercambio iónico.

Descripción de la técnica relacionada La purificación a gran escala económica de proteínas es un problema cada vez más importante para la industria biotecnológica. En general, las proteínas se producen mediante cultivos celulares, usando líneas celulares eucariotas o procariotas modificadas por ingeniería genética para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Ya que las células normalmente usadas son organismos vivos, tienen que alimentarse con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares,

aminoácidos, y factores de crecimiento, generalmente suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada a partir de la mezcla de compuestos alimentados a las células y de los subproductos de las células en sí, hasta una pureza suficiente para su uso como agente terapéutico para seres humanos supone un desafío formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de restos celulares dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Puede hacerse que algunas proteínas se secreten directamente de la célula al medio de crecimiento circundante; otras se producen intracelularmente. Para las últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de purificación incluye la lisis de la célula, que puede efectuarse mediante varios métodos, incluyendo cizalla mecánica, choque osmótico, o tratamientos enzimáticos. Dicha disrupción libera el contenido entero de la célula al

homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. Estos se eliminan generalmente mediante centrifugación diferencial o mediante filtración. El mismo problema surge, aunque a menor escala, con proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células y a la liberación de proteínas intracelulares de las células huésped durante el trascurso del ciclo de producción de proteína.

Una vez se ha obtenido una solución aclarada que contiene la proteína de interés, su separación de las demás proteínas producidas por la célula se intenta frecuentemente usando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobicidad, o tamaño. Hay disponibles varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, permitiendo una adaptación precisa del esquema de purificación para la proteína concreta involucrada. La esencia de cada uno de estos métodos de separación es que puede hacerse que las proteínas se muevan a diferentes velocidades a través de una columna, logrando una separación física que aumenta a medida que pasan más hacia abajo en la columna, o puede hacerse que se adhieran selectivamente al medio de separación, eluyéndose de manera diferencial por diferentes solventes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna, y la proteína de interés no, es decir, la proteína de interés está presente en el

"flujo a través".

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica cromatográfica que se usa de manera común para la purificación de proteínas. En la cromatografía de intercambio iónico, las partes cargadas en la superficie del soluto son atraídas por cargas opuestas unidas a la matriz de cromatografía, siempre que la fuerza iónica del tampón circundante 50 sea baja. La elución se logra generalmente aumentando la fuerza iónica (es decir, conductividad) del tampón para competir con el soluto por los sitios cargados de la matriz de intercambio iónico. Cambiar el pH y por tanto alterar la carga del soluto es otro modo de lograr la elución del soluto. El cambio en la conductividad o el pH puede ser gradual (elución de gradiente) o paso a paso (elución por etapas) . En el pasado, estos cambios han sido progresivos; es decir, el pH o conductividad se aumenta o disminuye en una sola dirección.

Las Patentes de los Estados Unidos Nº 6.339.142 y 6.417.355 (Basey et al.) describen cromatografía de intercambio iónico para purificar polipéptidos.

Las Patentes de los Estados Unidos Nº 6.127.526 y 6.333.398 (Blank, G.) describen la purificación de proteínas, tales 60 como anticuerpos anti-HER2, mediante cromatografía de proteína A.

Sumario de la invención La presente invención es como se describe en las reivindicaciones. 65

Breve descripción de los dibujos Las figuras 1A y 1B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de humMAb4D5-8 (SEC ID Nº : 1) y la cadena pesada de humMAb4D5-8 (SEC ID Nº : 2) , respectivamente.

La Figura 2 es un gráfico que ilustra un proceso de cromatografía con una etapa de lavado de gradiente lineal. La Figura 3 es un gráfico que ilustra un proceso de cromatografía con una etapa de lavado de gradiente multi-pendiente.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones La "composición" a purificar en el presente documento comprende al polipéptido de interés y uno o más contaminantes. La composición puede estar "prácticamente purificada" (es decir, que se ha sometido a una o más etapas de purificación, tales como cromatografía de proteína A) o puede obtenerse directamente a partir de una célula hospedadora u organismo que produce el polipéptido (por ejemplo, la composición puede comprender fluido de cultivo celular recogido) .

Como se usa en el presente documento, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Preferentemente, el polipéptido es una proteína de mamífero, cuyos ejemplos incluyen: renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina, hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor 25 tisular, y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes, tales como proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno de orina o de tipo tisular humano (t-PA) ; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (por sus siglas en inglés, regulated on activation normally T-cell expressed and secreted, regulada en la activación, normalmente expresada en y secretada por linfocitos T) ; proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa) ; una albúmina de suero, tal como albúmina de suero humana; sustancia inhibidora Muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE, un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico 35 derivado del hueso (BDNF) , neurotrofina 3, 4, 5, o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6) , o un factor de crecimiento nervioso tal como NFG-β; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento transformante (TGF) , tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, o TGF-β5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II) ; des (1-3) -IGF-I (IGF-I cerebral) , proteínas de unión a factor de crecimiento insulínico (IGFBP) ; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD2O; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética de hueso (BMP) ; un interferón, tal como interferón alfa, beta, y gamma; factor estimulador de colonias (CSF) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (IL) , por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y contaminantes,

en el que el polipéptido es un anticuerpo que se une a HER2 y en el que los contaminantes comprenden una variedad 5 desamidada del anticuerpo, y en donde el método comprende las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición sobre una resina de intercambio catiónico con un tampón de equilibrado que tiene una primera concentración de sal;

(b) lavar la resina de intercambio catiónico con un tampón de lavado hasta que se mide una concentración

predeterminada de proteína en el flujo a través, en donde la concentración de sal del tampón de lavado aumenta desde una segunda concentración de sal inicial que es mayor que la concentración de sal del tampón de equilibrado, a una tercera concentración final de sal;

(c) hacer pasar un volumen fijo de 0, 4 a 1 volumen de columna de tampón de lavado a la tercera concentración final de sal sobre la resina de intercambio catiónico; y

(d) eluir el polipéptido de la resina de intercambio catiónico con tampón de elución que tiene una concentración de sal que es mayor que la concentración final de sal del tampón de lavado.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la resina de intercambio catiónico comprende carboximetilcelulosa o sulfopropilo inmovilizado sobre agarosa. 20

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEC ID Nº : 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEC ID Nº : 2.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es rhuMAb HER2 que comprende la

secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEC ID Nº : 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEC ID Nº : 2, y en el que los contaminantes comprenden una variante desamidada que tiene Asn3O en CDR1 de una o ambas regiones VL del mismo convertido a aspartato.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se produce de manera 30 recombinante en células hospedadoras CHO.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo se produce intracelularmente y se separa de restos en partículas de las células hospedadoras mediante centrifugación o ultrafiltración antes de la cromatografía de intercambio iónico.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se somete a cromatografía de proteína A antes de la cromatografía de intercambio catiónico.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la cantidad de anticuerpo en la composición 40 cargada sobre la resina de intercambio iónico es de 15 mg a 45 mg por ml de resina de intercambio catiónico.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la concentración predeterminada de proteína en la etapa (b) corresponde a una DO de 0, 6 medida a 280 nm.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el tampón de lavado comprende una mezcla de tampón de equilibrado y tampón de elución, y en el que el aumento en la concentración de sal del tampón de lavado durante la etapa (b) se logra aumentando la proporción de tampón de elución en el tampón de lavado.

11. El método de la reivindicación 10 en el que la proporción de tampón de elución en el tampón de lavado aumenta a 50 una velocidad constante.

12. El método de la reivindicación 10 en el que el porcentaje de tampón de elución en el tampón de lavado aumenta a dos o más velocidades diferentes durante el trascurso del lavado en la etapa (b) .

13. El método de la reivindicación 12 en el que el porcentaje de tampón de elución en el tampón de lavado aumenta a una primera velocidad durante un primer segmento del lavado, a una segunda velocidad durante un segundo segmento del lavado y a una tercera velocidad durante un tercer segmento del lavado.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el tampón de elución comprende Na 145

mM/HOAc y el tampón de equilibrado comprende Na 70 mM/HOAc, o en el que el tampón de elución comprende NaCl 100 mM y el tampón de equilibrado comprende NaCl 45 mM.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende someter a la composición que comprende al polipéptido a una o más etapas de purificación adicionales para obtener una preparación homogénea del 65 polipéptido.

16. El método de la reivindicación 15, que además comprende preparar una composición farmacéutica combinando la preparación homogénea del polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. El método de la reivindicación 15, que además comprende conjugar el polipéptido purificado con una molécula heteróloga.

18. El método de la reivindicación 17, en el que la molécula heteróloga es polietilenglicol, un marcador o un agente citotóxico.