Promotor sintético inducible por patógenos.

Promotor sintético inducible por patógenos que es apropiado para la regulación de la transcripción de un ácido nucleico y comprende un promotor mínimo,

caracterizado por que

a) el promotor mínimo presenta un motivo de secuencia twcccmt dispuesto cadena abajo de una región TATA y delante de un punto de inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular, apareciendo el motivo de secuencia en el promotor mínimo dos o varias veces y/o

b) el promotor mínimo presenta un motivo de secuencia twcccmt dispuesto cadena abajo de una región TATA y delante de un punto de inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular, y en el que el promotor sintético inducible por patógenos presenta junto al promotor mínimo al menos un elemento regulador cis con una secuencia de nucleótidos según una de las SEC. ID. Nº: 10 - 15.

Promotor sintético inducible por patógenos La presente invención se refiere a un promotor sintético inducible por patógenos que es apropiado para la regulación de la transcripción de un ácido nucleico y comprende un promotor mínimo. Además, la presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica así como a plantas transgénicas. La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción de una planta resistente frente a patógenos.

Se conocen diferentes procedimientos para la obtención de plantas resistentes contra patógenos como hongos, virus, bacterias y nematodos. Algunos de estos procedimientos emplean la reacción de hipersensibilidad (RH) de la planta, produciéndose la formación de necrosis en el punto de contacto directo entre patógeno y planta. A consecuencia de la RH, en las células vecinas se inicia un amplio espectro de medidas de defensa contra patógenos, las cuales impiden que continúe el avance del patógeno en el tejido vegetal.

La RH se puede producir tras la expresión de genes efectores, como por ejemplo genes de avirulencia de un patógeno y la interacción con el producto de un gen de resistencia correspondiente (gen R) . Así, el gen R puede existir en la planta o se puede insertar en el correspondiente genoma vegetal mediante métodos de ingeniería genética (Stuiver y col. 1998, Keller y col., 1999, Belbahri y col., 2001) . Además, una sobreexpresión o autoactivación de los genes R puede conducir a la activación de una RH (Tao y col., 2000, Tang y col., 1999, Bendahmane y col., 2002, Howles y col., 2005) . Mediante la sobreexpresión de un gen R se sobrepasa un valor límite que conduce a la activación de una cascada de señales que normalmente sólo se desencadena por la presencia del patógeno o su producto del gen de avirulencia. Mediante la activación de esta cascada se puede obtener una resistencia de amplia eficacia contra patógenos (Oldroyd y Staskawicz, 1998, Tang y col., 1999, Tao y col., 2000, Howles y col., 2005) . Como genes R autoactivos se describen aquellos genes R que se modificaron hasta el punto que para la activación de nuevo de la cascada de señales no es necesaria la presencia del patógeno/producto del gen de avirulencia y al mismo tiempo es suficiente una cantidad de expresión reducida en comparación con la forma no modificada para conseguir la activación de la cascada de señales.

Stuiver y col. (1998) pudieron mostrar que la transformación del gen avr9 del hongo fitopatógeno Cladosporium fulvum bajo el control del promotor Gst1 inducible por patógenos procedente de la patata en plantas de tomate que llevan el gen Cf9 correspondiente condujo a una resistencia a los hongos de amplia eficacia. Se pudo obtener una resistencia contra el oomiceto Phytophthora parasitica var nicotianae en Nicotiana tabacum después de que se transformara el inductor criptogeína de P. cr y ptogea o el inductor bacteriano popA de la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum en N. tabacum. Ambos genes estuvieron bajo el control del promotor inducible por patógenos hsr203J de N. tabacum (Keller y col., 1999, Belbahri y col., 2001) .

El sistema de la activación de la RH requiere un control estricto de la expresión del gen efector en el lugar de la infección. En la expresión incontrolada, la expresión del gen efector provoca efectos negativos en el crecimiento de las plantas y por tanto en el rendimiento de plantas de cultivo (Stuiver y Custers, 2001) . No obstante, se puede realizar una expresión controlada mediante la selección de promotores adecuados inducibles por patógenos. Estos no deberían permitir ninguna expresión o permitir sólo una expresión baja en condiciones sin ataque, aunque en caso de ataque inducen una expresión claramente mayor en el lugar de la infección. Tras la transformación de dos formas autoactivas diferentes del gen de resistencia a la roya L6 del lino (Linum usitatissimum) en lino bajo el control del promotor natural Fis1 del lino inducible por roya se pudieron determinar dos fenotipos. Por un lado, las plantas de crecimiento normal que no mostraron ninguna resistencia mejorada contra patógenos, por otro lado las plantas de bajo crecimiento con amplia resistencia contra patógenos (Howles y col., 2005) . Estos resultados muestran que según la forma empleada del gen R autoactivo se produce una actividad del promotor que se puede encontrar ya por encima del valor límite de inducción de la cascada de señales, mientras en las plantas fenotípicamente discretas la inducción del promotor Fis1 no basta para conseguir el valor límite. Por tanto, la especificidad del promotor Fis1 natural no es suficiente para conseguir una resistencia de amplia eficacia frente a patógenos sin efectos negativos en el crecimiento de la planta.

Los promotores naturales inducibles por patógenos muestran a menudo una actividad demasiado inespecífica y son activados por numerosos estímulos, de modo que su uso para la expresión de los genes efectores mencionados arriba no tiene sentido, ya que también se puede producir una activación RH bajo condiciones sin infección. Esta fuga de los promotores conduce a una afectación del crecimiento de la planta y por tanto a una reducción del rendimiento de la cosecha en plantas cultivadas. Por consiguiente, se han desarrollado promotores sintéticos que contienen motivos de secuencia (elementos reguladores cis) procedentes de promotores naturales inducibles por patógenos que son relevantes para la inducción por patógenos. Por el contrario, se eliminan los motivos de secuencia para otros estímulos. Los elementos reguladores cis se clonaron cadena arriba de un promotor mínimo, de modo que se consiguió un promotor funcional que presenta una elevada especificidad en comparación con los promotores naturales a partir de los cuales se aislaron los correspondientes elementos reguladores cis (Rushton y col., 2002) . Como promotor mínimo para plantas dicotiledóneas se empleó la región -46 a +8 del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor. Además, se conoce el uso de un promotor mínimo a partir de un promotor natural, del que

se clonó el correspondiente elemento regulador cis (Perl-Treves y col., 2004) . Para plantas monocotiledóneas se describe el uso del promotor mínimo del gen Act1 del arroz (Lü y col., 2000) .

Aunque los promotores sintéticos descritos son superiores a los promotores naturales, siguen mostrando actividad de fondo incluso en condiciones sin ataque. Esta actividad de fondo fluctúa entre especies de plantas individuales. Así, en todas las especies de plantas estudiadas hasta ahora se ha podido constatar inducibilidad por patógenos, aunque fluctúan las intensidades de la inducción y la actividad absoluta de los promotores. Así, debido a una actividad de fondo demasiado intensa en tejido no infectado sólo se puede determinar una baja capacidad de inducción por patógenos como cociente de la actividad del promotor en el tejido infectado dividido por la actividad del promotor en el tejido no infectado.

Hasta ahora sólo se ha hecho responsables de la cantidad de actividad de fondo de un promotor sintético a los elementos reguladores cis usados. Estos tienen una influencia muy grande en la fuerza del promotor (Rushton y col., 2002) . La influencia del promotor mínimo se ha estudiado poco hasta ahora. Según los datos bibliográficos el promotor mínimo tiene muy poca influencia en la regulación de la actividad del promotor (Singh, 1998) . Sin embargo, Bhullar y col. (2003) pudieron observar una clara reducción de la actividad promotora del promotor 35S cuando se intercambió el promotor mínimo (-46 a +1) por promotores mínimos vegetales heterólogos. Estas diferencias se atribuyeron a secuencias diferentes de las cajas TATA, mientras en su opinión las regiones que flanquean la caja TATA del promotor mínimo no fueron relevantes para la actividad del promotor.

Por tanto, es objetivo de la presente invención proporcionar un promotor sintético inducible por patógenos con baja actividad de fondo.

Según la invención el objetivo propuesto se alcanza mediante un promotor sintético inducible por patógenos con un promotor mínimo, presentando el promotor mínimo un motivo de secuencia twcccmt que está dispuesto cadena abajo de una región TATA y antes de un punto de inicio de transcripción situado sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular y apareciendo el motivo de secuencia en el promotor mínimo dos o varias veces y/o presentando el promotor mínimo un motivo de secuencia twcccmt que está dispuesto cadena abajo de una región TATA y antes de un punto de inicio de transcripción situado sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se... [Seguir leyendo]

1. Promotor sintético inducible por patógenos que es apropiado para la regulación de la transcripción de un ácido nucleico y comprende un promotor mínimo, caracterizado por que

a) el promotor mínimo presenta un motivo de secuencia twcccmt dispuesto cadena abajo de una región TATA y delante de un punto de inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular, apareciendo el motivo de secuencia en el promotor mínimo dos o varias veces y/o b) el promotor mínimo presenta un motivo de secuencia twcccmt dispuesto cadena abajo de una región TATA y delante de un punto de inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular, y en el que el promotor sintético inducible por patógenos presenta junto al promotor mínimo al menos un elemento regulador cis con una secuencia de nucleótidos según una de las SEC. ID. Nº : 10 – 15.

2. Promotor sintético inducible por patógenos según la reivindicación 1, en el que el promotor mínimo presenta una secuencia de nucleótidos según la SEC. ID. Nº 8 o la SEC. ID. Nº 9.

3. Promotor mínimo para la producción de un promotor sintético inducible por patógenos que es apropiado para la

regulación de la transcripción de un ácido nucleico, caracterizado por que el promotor mínimo presenta un motivo de secuencia twcccmt dispuesto cadena abajo de una región TATA y delante de un punto de inicio de transcripción dispuesto sobre el promotor mínimo, en el que empieza la transcripción del ácido nucleico que se tiene que regular, apareciendo el motivo de secuencia en el promotor mínimo dos o varias veces.

4. Promotor mínimo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que el promotor mínimo presenta una secuencia de nucleótidos según la SEC. ID. Nº 8 o la SEC. ID. Nº 9.

5. Gen recombinante con un promotor sintético inducible por patógenos según la reivindicación 1 o 2 o un promotor

mínimo de acuerdo con la reivindicación 3 o 4. 30

6. Célula vegetal transgénica en la que un promotor sintético inducible por patógenos según la reivindicación 1 o 2 o un promotor mínimo de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 se ha integrado en el ADN de la célula vegetal.

7. Planta transgénica con una célula vegetal según la reivindicación 6. 35

8. Semilla transgénica con una célula vegetal según la reivindicación 6.

9. Procedimiento para la obtención de una planta resistente contra patógenos, en el cual en una célula vegetal se introduce un ácido nucleico apropiado para la producción de una defensa contra patógenos, el cual se encuentra

bajo el control de un promotor sintético inducible por patógenos y a continuación a partir de esta célula vegetal se regenera una planta, caracterizado por que el promotor sintético inducible por patógenos es un promotor sintético inducible por patógenos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.