Producción de proteínas en semillas de plantas.

Una planta monocotiledónea transgénica que comprende: (a) un promotor específico de maduración de las semillas (b) ligada de modo operable a dicho promotor,

una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas capaz de elegir como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiledóneas y (c) una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA está ligada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA.

Producción de proteínas en semillas de plantas.

Fundamento de la invención

Expresión de proteínas heterólogas en semillas de plantas

La expresión de proteínas heterólogas en semillas de plantas ofrece la posibilidad, por ejemplo, de producir grandes cantidades de polipéptidos recolectados con facilidad, y de expresar proteínas que mejoran la calidad de sus granos. Discusiones de estos conceptos pueden encontrarse en la patente de EE.UU. No. 5.714.474 (Producción de enzimas en semillas y sus usos) .

Proteínas de reserva hordeínas

Las proteínas de reserva de las semillas de la cebada representan, aproximadamente, 8 a 15% del peso seco de los granos maduros de la cebada. Las principales proteínas de reserva de las semillas de la cebada son prolaminas solubles en alcohol, denominadas hordeínas, clasificadas en dos grupos principales, B y C, y dos grupos menores, D y γ (Shewr y , 1993) . Dependiendo de los niveles de nitrógeno, estos 4 grupos representan, aproximadamente, 35 a 55% de la proteína total de las semillas de la cebada. Las hordeínas B y C representan, aproximadamente, 70 a 80% y 10 a 20%, respectivamente, de la fracción total de hordeínas, con pequeñas cantidades de hordeínas D (2-4%) y γ (sin determinar con precisión) . Las hordeínas B, D y γ son prolaminas ricas en azufre mientras que las hordeínas C son prolaminas pobres en azufre (Bright y Shewr y , 1983) . Las hordeínas son sintetizadas coordinadamente en el tejido del endospermo amiláceo en desarrollo (Giese et al., 1983; Sørensen et al., 1989) . Estas hordeínas son transportadas conjuntamente en la traducción al lumen del retículo endoplásmico rugoso, con escisión simultánea del péptido señal, y son depositadas finalmente en los cuerpos proteínicos (Cameron-Mills, 1980; Cameron-Mills y von Wettsein, 1980; Cameron-Mills y Madrid, 1989) .

Análisis genéticos realizados ponen de manifiesto que todas las hordeínas están codificadas por genes estructurales sobre el cromosoma 5 (1H) de la cebada; los lugares Hor1, Hor2, Hor3 y Hor5 sobre el cromosoma 5 codifican los polipéptidos de las hordeínas C, B, D y γ, respectivamente (Jensen et al., 1980; Shewr y et al., 1980; Blake et al., 1982; Shewr y et al., 1983; Shewr y y Parmar, 1987) . Los genes para las hordeínas B, C y D han sido aislados y caracterizados (Brandt et al., 1985; Forde et al., 1985; Rasmussen y Brandt, 1986; Sørensen et al., 1996) . Las hordeínas B y C están codificadas por familias multigénicas que comprenden 10 a 20 miembros mientras que la hordeína D está codificada por un solo gen (Brandt et al, 1985; Rasmussen y Brandt, 1986; Sørensen et al., 1996) . La regulación y expresión de estos promotores de hordeínas han sido estudiadas mediante ensayos de expresión transitoria (Entwistle et al., 1991; Müller y Knudsen, 1993; Sørensen et al., 1996) en el endospermo de la cebada. Como ha sido determinado por estos ensayos usando fusiones de promotor-uidA, el promotor de la hordeína D es 3 a 5 veces más activo que los promotores de las hordeínas B y C ensayados (Sørensen et al., 1996) El promotor de la hordeína B ha sido estudiado también usando la transformación estable del tabaco con las fusiones de promotor-cat (Marris et al., 1988) .

Aún cuando los genes para las hordeínas B, C y D han sido aislados y caracterizados, su regulación y su expresión solamente han sido estudiadas en ensayos de expresión transitoria en la cebada y en el tabaco transformado establemente (Brandt et al., 1985; Forde et al., 1985; Marris et al., 1988; Sørensen et al., 1996) .

En la cebada, el trigo y el maíz, las principales proteínas de reserva del tipo prolamina, altamente insolubles, son sintetizadas sobre polisomas estrechamente vinculadas con el retículo endoplásmico (ER) (Véase Seeds: Physiology of Development and Germination, 2ª ed. compiladores Bewley y Black, Plenum Press, Nueva York, 1994) . Las proteínas nuevamente sintetizadas atraviesan la membrana del ER hacia el lumen, donde se agregan en partículas pequeñas, que finalmente forman agregados y cuerpos proteínicos de mayor tamaño (que pueden observarse en micrografías electrónicas) .

En el trigo, dos tipos diferentes de cuerpos proteínicos se acumulan independientemente dentro del endospermo en desarrollo: cuerpos de baja densidad que se desarrollan más pronto y cuerpos de alta densidad que se desarrollan más tarde y que son derivados desde el ER. Las proteínas de alta densidad se forman cuando la agregación de proteínas en el interior del lumen produce esfuerzo sobre la membrana y ocasiona su rotura. La membrana puede reconstituirse sin el agregado de proteína al cabo de un intervalo en el que el propio cuerpo proteínico no está unido por una membrana. En otros cereales además del trigo y la cebada, tales como el mijo, el arroz, el maíz y el sorgo, los cuerpos proteínicos permanecen como entidades diferenciadas unidas a la membrana, incluso en las semillas maduras.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una planta monocotiledónea transgénica que comprende un promotor específico de la maduración de las semillas, y enlazada de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas capaz de elegir como diana un polipéptido enlazado a un cuerpo proteínico de reserva en semillas monocotiledóneas, y una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de las semillas, en donde la secuencia de DNA está enlazada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA, según se define en las reivindicaciones que se acompañan.

La invención proporciona también semillas transgénicas de estas plantas transgénicas, que son útiles como fuente del polipéptido expresado, o que pueden mejorar la calidad del grano.

En realizaciones particulares de la invención, las plantas transgénicas proporcionadas son plantas monocotiledóneas transformadas establemente, por ejemplo plantas de cereales, tales como la cebada o el trigo. En realizaciones particulares la invención proporciona plantas de cebada transformadas establemente a partir de genotipos que incluyen: Harrington, Morex, Cr y stal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptone, Klages y Baronesse. La invención proporciona también plantas de trigo transformadas establemente a partir de genotipos que incluyen. Anza, Karl, Bobwhite y Yecora Rojo.

La invención proporciona también semillas de plantas transformadas establemente que expresan en su semilla el polipéptido seleccionado. El polipéptido puede ser empleado para mejorar la calidad del grano o puede ser extraído de la semilla en el momento de máxima expresión o estabilidad para ser utilizado para otros fines.

Descripción breve de los dibujos

La Fig. 1A es un diagrama esquemático de una estrategia de cuatro cebadores para obtener productos quiméricos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

La Fig. 1B es un diagrama esquemático de una estrategia de tres cebadores para obtener productos quiméricos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

La Fig. 1C es un mapa de una construcción que incluye (desde 5' a 3') , el promotor de la hordeína B₁, la secuencia señal de la hordeína B₁, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3' de nos.

Las Figs. 2A y B muestran alineaciones de construcciones que comprenden el promotor de la hordeína B₁, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3' de nos con (2A) o sin (2B) la secuencia señal de la hordeína B₁.

La Fig. 3 muestra la secuencia de los ácidos nucleicos del promotor de la hordeína B₁ y la secuencia señal de lo hordeína B₁ de 57 pares de bases (subrayada) .

La Fig. 4 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor de la hordeína D y la secuencia señal de la hordeína D de 63 pares de bases (subrayada) .

La Fig. 5 es un diagrama de barras que muestra la actividad de GUS en semillas de cebada maduras que expresan construcciones que comprenden el promotor de la hordeína B₁, el gen uidA, y la secuencia de terminación de 3' de nos o bien con (+SS) o sin (-SS) la secuencia señal de la hordeína B₁.

La Fig. 6 es un diagrama de barras que muestra la actividad de GUS en semillas de cebada inmaduras que expresan construcciones que comprenden el promotor de la hordeína B₁, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3'...

1. Una planta monocotiledónea transgénica que comprende:

(a) un promotor específico de maduración de las semillas

(b) ligada de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas capaz de elegir como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiledóneas y

(c) una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA está ligada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA.

2. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal de DNA es una secuencia conductora del extremo amino terminal, específica de semillas monocotiledóneas.

3. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que el promotor está seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de glutelinas del arroz, orizinas del arroz, prolaminas del arroz, hordeínas de la cebada, gliadinas del trigo, glutelinas del trigo, zeínas del maíz, glutelinas del maíz, glutelinas de la avena, cafirinas del sorgo, penisetinas del mijo y secalinas del centeno.

4. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal de DNA está seleccionada entre las secuencias señal comprendidas en el grupo que consiste en genes de glutelina del arroz, globulina del arroz, hordeína D de la cebada y hordeína B₁ de la cebada.

5. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiledónea está seleccionada entre el grupo que consiste en arroz, cebada y trigo.

6. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiledónea es el arroz.

7. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiledónea es la cebada.

8. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta es el trigo.

9. Una semilla transgénica producida desde la planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, que comprende

(a) un promotor específico de maduración de las semillas

(b) ligado de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas, capaz de elegir como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiledóneas y

(c) una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA está ligada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA.

10. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la secuencia señal de DNA es una secuencia conductora del extremo amino terminal específica de semillas monocotiledóneas.

11. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que el promotor está seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de glutelinas del arroz, orizinas del arroz, prolaminas del arroz, hordeínas de la cebada, gliadinas del trigo, glutelinas del trigo, zeínas del maíz, glutelinas del maíz, glutelinas de la avena, cafirinas del sorgo, penisetinas del mijo y secalinas del centeno.

12. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la secuencia señal de DNA está seleccionada entre las secuencias señal comprendidas en el grupo que consiste en genes de glutelina del arroz, globulina del arroz, hordeína D de la cebada y hordeína B₁ de la cebada.

13. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea está seleccionada entre el grupo que consiste en arroz, cebada y trigo.

14. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea es el arroz.

15. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea es el trigo.

16. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea es la cebada.