Preparación de enzima que produce un sabor puro.

Procedimiento para producir un producto lácteo que comprende usar una preparación de una lactasa neutra de Kluyveromyces que comprende menos de 30 unidades de actividad de arilsulfatasa por unidad de lactasa neutra (NLU) de actividad de lactasa.

Preparación de enzima que produce un sabor puro Campo de la invención La invención se refiere a un procedimiento para producir un producto lácteo.

Antecedentes de la invención El uso de enzimas para mejorar la naturaleza química, fisico-química u organoléptica de productos de grado alimentario está ampliamente extendido. También en el procesamiento de leche de vaca y otros sustratos derivados de animales, el uso de enzimas añade un valor significativo al producto final. Los ejemplos son incubaciones con lactasa para hacer a la leche aceptable a individuos intolerantes con la lactosa, la hidrólisis proteolítica de caseína y proteínas del suero de la leche para aliviar alergenicidades y mejorar las características de espuma, la modificación de fosfolípidos del huevo usando fosfolipasa A2 para mejorar el comportamiento de cocción y estabilizar las mayonesas, el uso de transglutaminasa en productos de carne y de pescado para mejorar la dureza y elasticidad, así como la eliminación de oxígeno de los productos de huevo o queso rayado añadiendo glucosa oxidasa. Adicionalmente, los tratamientos enzimáticos se están usando para potenciar el sabor de diversos productos alimentarios derivados de animales. Por ejemplo, las proteasas están siendo usadas para acelerar el desarrollo de sabor en extractos de pescado y de carne. Además, la aceleración del desarrollo del sabor en queso es una diana bien conocida. Mientras que el EMC (queso modificado con enzimas) es un producto consolidado en el que se usan principalmente diversas lipasas, la aceleración de los cambios de sabor sutiles implicados en el envejecimiento de los quesos al añadir pequeñas cantidades de exoproteasas, lipasas o esterasas es un desarrollo más reciente.

La invención se refiere a lactasa. La lactasa o !-galactosidasa (E.C: 3.2.1.23) es una enzima que cataliza la hidrólisis de lactosa (un disacárido) en sus componentes monosacáridos glucosa y galactosa. La lactosa está presente en productos lácteos, y más específicamente la leche, leche desnatada, nata y otros productos lácteos. La ruptura de la lactosa se produce en la pared intestinal del cuerpo humano (y de otros mamíferos) por la presencia natural de lactasa.

Los problemas nutricionales y funcionales provocados por la lactosa en la mayoría de poblaciones que carecen de lactasa son bien conocidos y están descritos. Los miembros de tales poblaciones no pueden hidrolizar la lactosa, que en tales casos pasa al intestino grueso, donde produce deshidratación, pobre absorción de calcio, diarrea, flatulencia, eruptación y calambres, y, en casos graves, incluso diarrea acuosa explosiva.

Una aplicación industrial importante de la lactasa es en la producción de productos lácteos con lactosa hidrolizada para individuos intolerantes a la lactosa. Tales producto lácteos hidrolizados incluyen leche pasteurizada, leche UHT y leche reconstituida de todos o de parte de sus constituyentes originales con o sin etapas de procesamiento intermedias tales como hidrólisis proteica. El tratamiento con lactasa se puede realizar antes o después del tratamiento térmico de la leche. El tratamiento con lactasa se puede realizar añadiendo la enzima a la leche. Las propiedades de solubilidad de la lactosa son tales que pueden conducir a su cristalización, conduciendo a una textura arenosa o grumosa. Tal textura indeseada se puede encontrar en algunos productos lácteos tales como leche condensada, leche evaporada, leche seca, leche congelada, helado, y en productos de pastelería con un contenido elevado de leche. La hidrólisis completa o parcial de la lactosa por lactasa elimina este problema, proporcionando productos con una textura homogénea y, como resultado, una mayor aceptación por el consumidor.

Otra aplicación industrial de la lactasa es para incrementar el sabor dulce en productos que contienen lactosa, como la leche o el yogur. La hidrólisis de la lactosa en tales productos da como resultado un mayor sabor dulce como resultado de la producción de glucosa. Otra aplicación industrial de lactasa es la hidrólisis de productos de lactosa que contienen componentes lácteos, tales como el pan. La lactosa se añade en tales productos para potenciar el sabor, retener la humedad, proporcionar un color pardo y mejorar las propiedades de tostado. Los jarabes de lactosa hidrolizada son prometedores en términos de, por ejemplo, potenciar el desarrollo del color de la corteza, mejorar el sabor y el aroma, modificar la textura, prolongar el período de caducidad, y robustecer la estructura de la hogaza.

La hidrólisis de la lactosa por lactasa en productos lácteos fermentados, tales como yogur, aumentará el sabor dulce. Sin embargo, cuando se añade la lactasa antes del comienzo del proceso fermentativo, puede incrementar la velocidad de desarrollo de ácido, y reducir de este modo los tiempos de procesamiento. El tratamiento con lactasa de leche o productos derivados de la leche tales como el suero hace a tales productos adecuados para la aplicación en piensos para animales y alimentos para mascotas para aquellos animales intolerantes a la lactosa, tales como gatos. La hidrólisis de la lactosa permite la fabricación de suero lácteo más concentrado y, al mismo tiempo, evita problemas del intestino, similares a los descritos previamente para pacientes con deficiencia de lactosa. El suero lácteo con lactosa hidrolizada se concentra para producir un jarabe que contiene 70-75% de sólidos, y se usa como ingrediente alimentario en helado, productos de panadería y de pastelería.

Las lactasas se han descrito para y aislado de una gran variedad de organismos, incluyendo microorganismos. La lactasa es a menudo un componente intracelular de microorganismos como Kluyveromyces y Bacillus. Kluyveromyces y especialmente K. fragilis y K. lactis, y otras levaduras tales como aquellas de los géneros Candida,

Torula y Torulopsis, son una fuente habitual de lactasas enzimáticas de levaduras, mientras que B. coagulans o B. circulans son fuentes bien conocidas para lactasas bacterianas. Existen varias preparaciones de lactasa comerciales, derivadas de estos organismos, tales como Maxilact® (de K. lactis, producida por DSM, Deflt, Países Bajos) . Todas estas lactasas son denominadas lactasas neutras, puesto que tienen un óptimo de pH entre pH = 6 y pH = 8. Varios organismos tales como Aspergillus niger y Aspergillus or y zae pueden producir lactasa extracelular, y la patente US 5.736.374 describe un ejemplo de tal lactasa, producida por Aspergillus or y zae. Las propiedades enzimáticas de lactasas como óptimo de pH y de temperaturas varían entre especies. En general, sin embargo, las lactasas que son excretadas muestran un menor óptimo de pH de pH = 3, 5 a pH = 5, 0; las lactasas intracelulares muestran habitualmente un mayor óptimo de pH en la región de pH = 6, 0 a pH = 7, 5, pero se producen excepciones a estas reglas generales. La elección de una lactasa neutra o ácida depende del perfil de pH en la aplicación. En aplicaciones con pH neutro, habitualmente se prefieren lactasas neutras; tales aplicaciones incluyen leche, helado, suero lácteo, queso, yogur, leche en polvo, etc. Las lactasas ácidas son más adecuadas para aplicaciones en el intervalo ácido. La concentración apropiada de lactasa depende de la concentración inicial de lactosa, del grado requerido de hidrólisis, del pH, la temperatura y del tiempo de hidrólisis.

Aunque dirigido a mejorar la funcionalidad y/o perfiles de sabor del producto alimentario, ocasionalmente un tratamiento enzimático puede tener efectos secundarios inesperados e indeseables. Un ejemplo de un efecto secundario indeseable es el desarrollo de un sabor rancio como resultado del tratamiento enzimático.

Mettall et. al, The Australian Journal of Dair y Technology, (1991) , 46-48, describen el problema del desarrollo de un sabor rancio cuando la leche es tratada con lactasa. Según esta publicación, niveles elevados de proteasa darán como resultado el desarrollo rápido de sabores rancios. Por lo tanto, los procedimientos de producción se optimizan para minimizar actividades secundarias proteolíticas, a fin de reducir el riesgo de la formación de sabor rancio. En el documento WO 02/081673 se describe un ejemplo de un procedimiento de purificación para lactasa derivada de K. lactis.

Se encuentra que incluso las preparaciones de lactasa con baja actividad de proteasa pueden todavía dar lugar a la formación de un sabor rancio. Este es especialmente el caso para las lactasas neutras, derivadas del citoplasma de levadura. La formación del sabor rancio que está asociada con el uso de preparaciones de lactasa es especialmente crítica para leche UHT con lactosa hidrolizada. Las lactasas que se usan en este caso son lactasas neutras debido a su óptimo... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir un producto lácteo que comprende usar una preparación de una lactasa neutra de Kluyveromyces que comprende menos de 30 unidades de actividad de arilsulfatasa por unidad de lactasa neutra (NLU) de actividad de lactasa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha lactasa comprende menos de 20 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa, más preferiblemente menos de 10 unidades de actividad de arilsulfatasa por NLU de actividad de lactasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha lactasa es una lactasa producida intracelularmente.

4. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha lactasa es una lactasa de K. lactis.

5. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha lactasa tiene un óptimo de pH entre pH = 6 y pH = 8.

6. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha lactasa tiene menos de 0, 5 unidades de fluorescencia relativa (RFU) /min. de actividad de proteasa por NLU de actividad de lactasa.

7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho producto lácteo es leche.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha leche es leche de vaca.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que dicha leche es leche UHT.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha lactasa se obtiene purificando una preparación de enzima bruta que contiene lactasa y arilsulfatasa, en el que la arilsulfatasa se separa de la enzima de interés.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha purificación da como resultado una reducción de la actividad de arilsulfatasa de al menos 50%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 99%.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicha purificación es mediante cromatografía, preferiblemente en una única etapa de separación cromatográfica.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha lactasa se obtiene mediante un método que comprende:

(a) cultivar una célula de Kluyveromyces deficiente en arilsulfatasa en un medio nutriente, en condiciones que conduzcan a la expresión de lactasa

(b) expresar la lactasa en dicha célula de Kluyveromyces, y

(c) recuperar opcionalmente la lactasa del medio nutriente o de la célula de Kluyveromyces.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha lactasa se obtiene mediante un método que comprende:

(a) transformar una célula de Kluyveromyces deficiente en arilsulfatasa con un vector de expresión, en el que el vector expresa la lactasa,

(b) cultivar la célula de Kluyveromyces en un medio nutriente, en condiciones que conduzcan a la expresión de la lactasa

(c) expresar la lactasa en la célula de Kluyveromyces, y

(d) recuperar opcionalmente la lactasa del medio nutriente o de la célula de Kluyveromyces.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha lactasa se obtiene mediante un método que comprende:

(a) cultivar una célula de Kluyveromyces en un medio nutriente que prohíbe la producción de arilsulfatasa y en condiciones que conduzcan a la expresión de la lactasa

(b) expresar la lactasa en dicha célula de Kluyveromyces, y

(c) recuperar opcionalmente la lactasa del medio nutriente o de la célula de Kluyveromyces.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha lactasa se obtiene mediante

un método que comprende:

(a) transformar una célula de Kluyveromyces con un vector de expresión, en el que el vector expresa la lactasa,

(b) cultivar la célula de Kluyveromyces en un medio nutriente que prohíbe la producción de arilsulfatasa y en 5 condiciones que conduzcan a la expresión de la lactasa

(c) expresar la lactasa en la célula de Kluyveromyces, y

(d) recuperar opcionalmente la lactasa del medio nutriente o de la célula de Kluyveromyces.

17. Uso de una preparación de una lactasa neutra procedente de Kluyveromyces que comprende menos de 30

unidades de actividad de arilsulfatasa por unidad de lactasa neutra (NLU) de actividad de lactasa, para producir un 10 producto lácteo.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que dicho producto lácteo es leche.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que dicha leche es leche de vaca.

20. Uso según la reivindicación 18 ó 19, en el que dicha leche es leche UHT.